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专利号: 2017101845371
申请人: 陕西师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体,其特征在于,在表达的sgRNA-AZ 2.0骨架的四碱基环(tetraloop)以及茎环2(stem loop2)位置插入适体核酶P1-F5;通过Kpn Ⅰ与EcoR Ⅰ位点和EcoR Ⅰ与Spe Ⅰ位点分别将U6启动子、sgRNA-AZ 2.0骨架依次连入载体pUC19/EKSHL中,获得载体pU6-sgRNA-AZ 2.0;使用BsaⅠ酶切载体pU6-sgRNA-AZ 2.0,并利用粘性末端连入针对目标基因的sgRNA序列,获得pU6-sgRNA-AZ 2.0-target site。

2.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体,其特征在于:

所述的插入适体核酶P1-F5的序列为:

GGCCCTGAGATGCAGGTACATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAAGCCATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGGGTTCCTGGATTCCACTGCTATCCACGGCC。

3.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体,其特征在于,所述sgRNA-AZ 2.0骨架的完整序列为:

GAATTCGGTCTCCGTTTTAGAGCTAGGCCCTGAGATGCAGGTACATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAAGCCATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGGGTTCCTGGATTCCACTGCTATCCACGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCCTGAGATGCAGGTACATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAAGCCATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGGGTTCCTGGATTCCACTGCTATCCACGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTACTAGT。

4.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体,其特征在于,所述的U6启动子序列如下:

GGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGAGACCGAATTC。

5.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体,其特征在于,所述的载体pU6-sgRNA-AZ 2.0完整序列为:GGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGAGACCGAATTCGGTCTCCGTTTTAGAGCTAGGCCCTGAGATGCAGGTACATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAAGCCATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGGGTTCCTGGATTCCACTGCTATCCACGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCCTGAGATGCAGGTACATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAAGCCATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGGGTTCCTGGATTCCACTGCTATCCACGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTACTAGT。

6.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体,其特征在于,所述的针对目标基因的sgRNA序列是针对目标基因编辑靶点,它们是针对GLRX3基因,VEGFA基因或者PGRN基因启动子中的任意一种。

7.如权利要求1所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体,其特征在于,所述的粘性末端连入针对目标基因编辑靶点的长度为19或20个核苷酸,退火构成其sgRNA片段的引物序列如下:GLRX3:ACCGTGAGGATAGGTAGGCCAAC与AAACGTTGGCCTACCTATCCTCA;

VEGFA:ACCGGGTGAGTGAGTGTGTGCGTG与AAACCACGCACACACTCACTCACC;

PGRN Pro:ACCGCGTCGGGACAGCCTCAGCA与AAACTGCTGAGGCTGTCCCGACG。

8.权利要求1至7其中之一所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体在基因组编辑中的应用。

9.权利要求1至7其中之一所述的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体在基因转录调控中的应用。