1.一种表达磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的细胞,其特征在于:所述表达磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的细胞为将含磷酸转移酶基因的表达质粒与含非核糖体肽合成酶基因的表达质粒转入宿主细胞中得到;所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3);所述含磷酸转移酶基因的表达质粒为将如SEQ ID NO:1所示的磷酸转移酶基因与pACYCDuet‑1质粒连接得到;所述含非核糖体肽合成酶基因的表达质粒为将如SEQ ID NO:2所示的非核糖体肽合成酶基因与pET28a质粒连接得到。
2.如权利要求1所述的表达磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的细胞,其特征在于:所述含磷酸转移酶基因的表达质粒按以下方法构建:利用引物对Bsusfp‑F和Bsusfp‑R对枯草芽孢杆菌的基因组进行PCR扩增,得到Bsusfp基因;
Bsusfp‑F 5’‑3’:
ACCATCATCACCACAGCCAG ATGAAGATTTACGGAATTTATATGGABsusfp‑R 5’‑3’:
GTGGCAGCAGCCTAGGTTAA TTATAAAAGCTCTTCGTACGAGACC利用引物对pACYC‑F和pACYC‑R对pACYCDuet‑1质粒进行反向PCR,得到线性化pACYC质粒;
pACYC‑F 5’‑3’:TTAACCTAGGCTGCTGCCAC
pACYC‑R 5’‑3’:CTGGCTGTGGTGATGATGGT
利用一步克隆试剂盒将所述Bsusfp基因和所述线性化pACYCDuet‑1质粒连接,获得插入Bsusfp基因的重组表达质粒pACYC‑sfp。
3.如权利要求1所述的表达磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的细胞,其特征在于所述含非核糖体肽合成酶基因的表达质粒按以下方法构建得到:将SEQ ID NO:2所示的优化后的果蝇ebony基因插在质粒pET28a的EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点之间,获得果蝇ebony基因的重组表达质粒pET28a‑ebony。
4.如权利要求1所述的表达磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的细胞,其特征在于所述表达磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的细胞按如下方法构建:(1)将含非核糖体肽合成酶基因的表达质粒转入宿主细胞:利用热激法将所述的含非核糖体肽合成酶基因的表达质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,所得转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上,经37℃过夜培养,挑取单克隆测序验证,获得所述含非核糖体肽合成酶基因的工程菌;
(2)将含磷酸转移酶基因的表达质粒转入含非核糖体肽合成酶基因的工程菌:将所述含非核糖体肽合成酶基因的工程菌制备成感受态细胞,利用热激法将pACYC‑sfp重组表达质粒转入,所得转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那霉素和100μg/mL氯霉素的LB固体培养基上,经37℃过夜培养,挑取单克隆测序验证,获得所述表达磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的细胞。
5.一种如权利要求1所述的表达磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的细胞经诱导表达得到的湿菌体。
6.如权利要求5所述的湿菌体,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:
将所述表达磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的细胞接种于LB培养基中,37℃,200rpm摇床震荡12h,获得种子液;将所述种子液以2%的接种量转接于新鲜LB培养基中,在37℃,
200rpm摇床震荡至OD600为0.6‑0.8,加入终浓度为0.3mM的异丙基硫代半乳糖苷,在20℃,
180rpm条件下诱导表达12h,12000rpm高速离心15min,弃上清,所得沉淀用pH 8,50mM的三氨基甲烷缓冲液重悬,8000rpm离心15min,弃上清,得到所述湿菌体。
7.一种如权利要求5所述的湿菌体在全细胞催化制备脱羧肌肽的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述应用为:
取所述湿菌体、β‑丙氨酸、氯化镁、ATP溶于pH 7的磷酸钠缓冲溶液,在25℃恒温振荡仪中进行反应,振荡反应转速为600~800r/min,反应30min后加入组胺,继续反应12‑48h,得到含脱羧肌肽的反应液;所述湿菌体的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为5g/L‑50g/L,所述β‑丙氨酸的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.22g/L‑8.91g/L;所述氯化镁的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.24g/L‑3.81g/L,所述ATP的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.55g/L‑22.04g/L;所述组胺的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.56g/L‑11.11g/L。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于:β‑丙氨酸和组胺的物质的量之比为1:0.1~
10。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于:β‑丙氨酸和组胺的物质的量之比为1:2。