1.一种定量检测海参多糖的方法,其特征在于,包括如下步骤:S1、向1.3mol/L的三氟乙酸水溶液中加入硫酸软骨素及岩藻糖,配制一系列浓度梯度的含有硫酸软骨素及岩藻糖的标准样品溶液;
所述硫酸软骨素及岩藻糖的浓度均在0.02~0.4mg/ml范围内;
S2、提取待测样品中的多糖:将待测样品粉碎、混匀后,准确称量,然后采用酶解后醇沉法提取、冻干,得到待测样品海参多糖提取物,向所述待测样品海参多糖提取物中加入三氟乙酸水溶液,所述三氟乙酸水溶液的浓度为1.3mol/L,得到待测样品海参多糖溶液;
所述待测样品为海参或海参制品;
S3、准确量取步骤S1制得的各浓度标准溶液及步骤S2制得的待测样品溶液、密封,分别准确1.00ml标准溶液和待测样品溶液,密封,在105℃下水解3h,放置室温,采用冷冻离心浓缩除去溶剂,收集固相;向所述固相物质中加入0.3~1mL甲醇或水,再采用冷冻离心浓缩除去溶剂,重复三次,达到除酸目的,得到各浓度标准样品溶液及待测样品溶液的固相残余物;
S4、向步骤S3制得的各样品溶液的固相残余物中分别加入等量的氨水溶解,再加入乳糖作为内标物,加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生化,得到含有硫酸软骨素二糖衍生物、岩藻糖衍生物的各浓度标准样品溶液及待测样品溶液;
S5、液相色谱-质谱联用检测步骤S4制得的含有硫酸软骨素二糖衍生物、岩藻糖衍生物的各浓度标准样品溶液及待测样品溶液,得到各样品中硫酸软骨素二糖衍生物和岩藻糖衍生物各自监测离子色谱峰面积;
检测条件为:
高效液相色谱-三重四极杆质谱仪;
色谱条件为:
反相色谱柱,
柱温30℃,
流动相20mmol乙酸铵-乙腈(88:12,V/V),流速0.5mL/min;
质谱条件:
离子源ESI源,
正离子模式检测,
喷雾电压5.5kV,
辅助加热气温度:600℃,
氮气作为碰撞气和喷雾气,
选择多重反应监测(MRM),监测的离子对包括673.3/175.0、687.3/175.0、495.2/
175.0;
S6、根据色谱峰保留时间和监测特征离子对区分内标乳糖衍生物、标样多糖的硫酸软骨素二糖衍生物和岩藻糖衍生物,然后以标样色谱峰面积和内标样峰面积的比值作为响应值,根据响应值和标准糖浓度绘制工作曲线,对照工作曲线,得出待测样品中硫酸软骨素和岩藻糖的含量;
S7、根据步骤S6得到的硫酸软骨素和岩藻糖的含量,结合公式(1)、(2)得到待测样品中岩藻聚糖和岩藻糖基化硫酸软骨素的含量;
X=mCS/A% (1),
Y=mFuc×M(Fuc-H2O)/M(Fuc)-X×(1-A%) (2),其中,X为岩藻糖基化硫酸软骨素的含量(mg/g),Y为岩藻聚糖的含量(mg/g),mCS为样品中硫酸软骨素的含量(mg/g),mFuc为样品中岩藻糖的含量(mg/g),A%为硫酸软骨素主链在岩藻糖基化硫酸软骨素所占比例。
2.根据权利要求1所述定量检测海参多糖的方法,其特征在于,步骤S1所述硫酸软骨素及岩藻糖浓度范围为0.04~0.2mg/ml。
3.根据权利要求1所述定量检测海参多糖的方法,其特征在于,步骤S2所述待测样品海参多糖溶液中每毫升三氟乙酸水溶液加入所述待测样品海参多糖提取物0.1~100mg。
4.根据权利要求1所述定量检测海参多糖的方法,其特征在于,步骤S4的具体操作为:将步骤S3制得的各样品溶液的固相残余物分别进行以下处理:将所述样品溶液的固相残余物全部加入到400μL的氨水中溶解,再加入1mg/ml的乳糖溶液100μL、0.3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液400μL,密封,70℃环境下反应
30min;反应结束后,加入1mL甲醇或水,离心浓缩除去溶剂,重复三次;再加入1mL的体积浓度为1%乙酸水溶液、1mL氯仿萃取,震荡后静置,除去氯仿,收集水相,重复萃取三次后,取最终的水相作为样品供试液。