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专利号: 2016110770191
申请人: 福建省农业科学院植物保护研究所
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-27
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1. 一种环介导恒温扩增法检测苜蓿根腐病菌的引物,其特征在于,包括一组外引物F3/B3和一组内引物FIP/BIP,所述引物序列如下: F3: 5’- CACCAAA CCCTCTTGGCG-3’,B3: 

5’- GGCGACATACCAATGACGG-3’,FIP: 5’- TTACCG AGCTCAGCGGCTTC-CGCATCACGTGGTTCACA-

3’,BIP: 5’- TGGGTCCTTG ACAAGCTCAAGG-GGGAGTCTCGAACTTCCAGA- 3’。

2.一种环介导等温扩增法检测苜蓿根腐病菌的方法,其特征在于,包括:

(1)提取待测样品基因组DNA;

(2)LAMP反应体系的建立:以步骤(1)提取的DNA为模板,利用权利要求1所述的外引物F3/B3和内引物FIP/BIP进行LAMP扩增,LAMP检测反应体系为25 μL,包括5 μM外引物F3和B3各1.0 μL,40 μM内引物FIP和BIP各1.0 μL,LAMP反应混合液12.5μL,8 U Bst聚合酶1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用灭菌超纯水补足至25μL;

(3)LAMP反应条件:64℃温育60 min;

(4)反应结果的测定:采用荧光染料目测观察法,待LAMP反应结束后,在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL,显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性,存在苜蓿根腐病菌,橙色或橘黄色判断为阴性,不存在苜蓿根腐病菌。

3. 根据权利要求2中所述的一种环介导等温扩增法检测苜蓿根腐病菌的方法,其特征在于,步骤(2)所述的LAMP反应混合液由以下组分组成:40 mM Tris-HCl,20 mM (NH4)2SO4,

20 mM KCl,16 mM MgSO4,1.6 mol/L甜菜碱,2.0 mM dNTPs,0.2wt.% Trion X-100。

4.如权利要求1所述的引物在苜蓿根腐病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。