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专利号: 2016104860966
申请人: 临沂大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-04-30
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种新的H9亚型禽流感卵黄抗体代替血清抗体监测的方法,其特征在于,步骤如下:(1)卵黄原料采集

鸡蛋采集是在养禽场中随机采集鸡蛋20枚或以上,保证采集的鸡蛋来自整个鸡群的分散度;将禽蛋用镊子在壳上轻轻敲开直径1cm的洞,撕开壳膜将蛋清完全倒出,再打开蛋壳将蛋黄完整倒入培养皿,进而挑开卵黄囊,用注射器直接避开表面蛋清抽取卵黄,将抽取到的卵黄注入到小烧杯中,玻棒搅匀使全部提取卵黄充分混匀,备用;

(2)卵黄抗体提取

A、水溶性处理液提取卵黄中抗体

吸取2ml提取卵黄加入离心管中,再加入2ml水溶性处理液,充分振荡混匀,室温放置

1h,得到浑浊的卵黄抗体提取液A,备用;

B、氯仿提取卵黄中抗体

吸取2ml提取卵黄加入离心管中,加入2ml磷酸盐缓冲液,混合后加入4ml氯仿,充分振荡混匀,室温放置1h,期间搅拌混匀3次,再通过3000r/min离心10min,出现分层,上层为卵黄抗体提取液B,分离备用;

(3)两种提取方式卵黄液的混合

将步骤2所得到的卵黄抗体提取液A与B按等量比例混合得混合液,即为监测用卵黄抗体样品;

(4)血凝试验

在微量血凝板上,自第1列孔至第12列孔,每孔加25μl PBS,吸取一定倍数稀释的H9亚型禽流感抗原25μl加于第1列孔,充分混合后移出25μl至第2列孔,依次类推做等量倍比稀释至第11列孔,第11列孔弃去25μL;设立第12列孔为红细胞对照;每孔再加25μl PBS;每孔各加入0.75%鸡红细胞悬液25μl;立即置微型振荡器上混合1min,或手持血凝板绕圆圈混匀1min;在室温下作用30min,或在4℃下作用60min;观察数次,直至对照的红细胞全部沉淀为一个圆点,将血凝板倾斜,观察红细胞有无泪珠样流挂,根据血凝图像判定结果;

血凝效价高于211时可继续增加稀释的孔数,以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价,此时血凝效价为2n,n>11,再根据初始稀释度计算抗原的血凝单位;并根据测定的抗原的血凝效价,计算4个血凝单位抗原的稀释倍数,制备4个血凝单位抗原;

(5)血凝抑制试验与效价确认

在微量血凝板上,自第1列孔至第12列孔,每孔加25μl PBS;

将步骤3的混合液,取体积25μl于第1列孔,混匀后由左向右顺序倍比稀释至第11列孔,最后弃去25μl;第1列孔至第12列孔分别加25μl含4个血凝单位的H9亚型禽流感抗原;立即置微型振荡器上混合1min,或手持血凝板绕圆圈混匀1min;在室温下作用30min,或在4℃下作用60min;每孔加0.75%鸡红细胞悬液25μl;混合后置室温下作用40min或在4℃下作用

60min,此时对照的红细胞已沉淀为一个圆点;血凝抑制效价高于211时可继续增加稀释的孔数,以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数为该混合液的血凝抑制效价,测定抗体效价加上修订系数即为卵黄抗体替代血清抗体的血凝抑制效价。

2.如权利要求1所述的一种新的H9亚型禽流感卵黄抗体代替血清抗体监测的方法,其特征在于:步骤(2)中所述的水溶性处理液为生理盐水、枸橼酸钠溶液或磷酸盐缓冲液中的任意一种。

3.如权利要求1所述的一种新的H9亚型禽流感卵黄抗体代替血清抗体监测的方法,其特征在于:步骤(3)中的按等量比例,是卵黄抗体提取液A:50%,卵黄抗体提取液B:50%。

4.如权利要求1所述的一种新的H9亚型禽流感卵黄抗体代替血清抗体监测的方法,其特征在于:所述步骤(5)得到的血凝抑制效价,加上修订系数,修订系数受疫苗、免疫时期、免疫程序等影响,修订后的效价作为卵黄抗体替代血清抗体的H9亚型禽流感血凝抑制效价。