1.一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法,其特征在于:所述的神经递质与衍生试剂4’-碳酰氯-罗丹明发生超声辅助-原位衍生反应,经超声辅助-分散液液微萃取富集纯化,得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测;
具体包括以下步骤:
a. 超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取:取20-50 µL神经递质标准品混合溶液或待测样品,30 µL内标物溶液、800-1500 µL pH 8.0-10.0的 NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液,加入离心管中,注入80-200 µL萃取剂和200-300 µL 4’-碳酰氯-罗丹明分散剂溶液,混合均匀后放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取,反应结束后高速离心,吸取下层有机相并用乙腈定容到200 µL,得氨基酸类和单胺类神经递质衍生化产物溶液;
所述内标物溶液是由10 µL浓度为1×10-5 mol/L异丙肾上腺素的乙腈溶液,10 µL浓度-5 -5 为1×10 mol/L 5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 µL浓度为1×10 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液组成;
所述的萃取剂为1-溴-3-甲基丁烷,溴代环己烷,1-溴代辛烷或溴苯;
所述的分散剂为丙酮,乙腈,甲醇或乙醇;
b. 将上述氨基酸类和单胺类神经递质衍生化产物溶液经滤膜过滤后,利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测;
所述4’-碳酰氯-罗丹明采用以下方法制备而成:将0.922 g 4’-羧基-罗丹明加入30 mL氯化亚砜,滴入0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺,磁力搅拌,升温至50~80℃,反应5~6 h,减压蒸除氯化亚砜,冷却至室温,得紫色固体,用乙醚重结晶,得紫色针状晶体即为4’-碳酰氯-罗丹明。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤a中所述的萃取剂为溴苯;所述分散剂为乙腈。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤a中所述的4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液的摩尔浓度为1×10-2 mol/L。
4. 根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述步骤a中所述超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取为在温度20-50℃,超声频率为40 KHz条件下反应1 -5 min。
5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述神经递质包括氨基酸类神经递质和单胺类神经递质;所述氨基酸类神经递质包括谷氨酸,γ-氨基丁酸,门冬氨酸,色氨酸,甘氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸;所述单胺类神经递质包括:左旋多巴,多巴胺,去甲肾上腺素,肾上腺素,3-甲氧酪胺,去甲变肾上腺素,变肾上腺素,高原儿茶酸,3,4-二羟基扁桃酸,DL-3,
4-二羟基苯基二醇,高香草酸,香草扁桃酸,3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇,羟色胺酸,5-羟色胺,5-羟吲哚乙酸,犬尿素,3-羟基犬尿氨酸,3-羟基邻氨基苯甲酸,犬尿酸。
6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱:2.1 mm × 50 mm,1.8 µm,进样体积为2 µL,柱温30 °C,采用梯度洗脱法。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于:所述的梯度洗脱法,流速为0.2 mL/min,流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸,流动相B为乙腈含有0.1%甲酸;色谱分离梯度条件为0 min流动相组成为95%A+5%B,3 min时85%A+15%B,5 min时65%A+35%B,12 min时5%A+95%B,16 min时5%A+95%B或0 min流动相组成为95%A+5%B,2 min时88%A+12%B,6 min时60%A+40%B,10 min时5%A+95%B,12 min时5%A+95%B。
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于:所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行检测时质谱的条件为:干燥气温度300 °C,流速10 L/min,喷雾器气压40 psi,鞘气温度280 °C,流速11 L/min,毛细管电压3.5 kV。