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专利号: 2015105061824
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-30
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,包括前处理阶段和提取阶段,其特征在于,前处理阶段包括下列步骤:

1)取一份布满菌丝体的培养基,粗研,置一洁净容器中;

2)加入适量的缓冲液I,至淹没过布满菌丝体的培养基,放置摇床,保持温度35~40℃,摇床转速100~150rpm摇动2~3h;缓冲液I:20mg/mL溶菌酶500μL+20mg/mL蛋白酶K 200μL+

0.02~0.1mmol/LpH 5.5~6.5PBS缓冲液配制成1000ml溶液;

3)取步骤2)的溶液,3000~4000rpm低速离心10~15min;溶液分成沉淀和上清液,收集上清液;

4)步骤3)中剩余的沉淀,加入缓冲液II洗涤,3000~4000rpm低速离心10~15min,洗涤过程重复2~5次,取每次洗涤后的上清液合并;缓冲液II:1mmol EDTA+10%SDS 10ml+0.02~0.1mmol pH 5.5~6.5PBS缓冲液配制成100ml 溶液;EDTA为乙二胺四乙酸;SDS为十二烷基磺酸钠;

5)将步骤3)和步骤4)离心的上清液集中到一起,在转速10000~12000rpm,4℃离心10~15min,弃上清液,收集沉淀。

2.如权利要求1所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤2)中缓冲液I的加入量为:缓冲液I与培养基的体积范围为(1.5∶1)~(4.0∶1)。

3.如权利要求1所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤4)中缓冲液II的加入量与培养基的体积比为(1:3)~(1.5:1)。

4.如权利要求1~3任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,提取阶段包括下列步骤:

1)加入TRIzol试剂,混匀;

2)10000~15000r/min,2~8℃,离心5~20min;

3)取上清,加入酚和氯仿混合液,摇匀4~10min,静置4~10min;

4)10000~15000r/min,2~8℃,离心5~20min;

5)取上清液,加入异丙醇,摇匀2~5min,放置~20℃冰箱中,静置20~60min;

6)10000~15000r/min,2~8℃,离心5~20min;

7)舍去上清液,留沉淀,加入乙醇冲洗;

8)10000~15000r/min,2~8℃,离心5~20min;

9)弃上清液,将其放入超净工作台,风干5~30min;

10)加入贮存液I,30~40℃作用10~20min,进一步采用RNA纯化试剂盒纯化RNA;贮存液I:1.2mL DEPC处理水+1mmol BSA+DNase I(RNase free)30U+RNase抑制剂40U配制成

100ml溶液;DEPC处理水:无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC),室温搅拌4小时以上,121度高压灭菌20分钟,冷却备用;

11)-40~-20℃冰箱中保存。

5.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤1)中,加入0.1~2ml TRIzol试剂。

6.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤3)中,取600μl上清,加入500~800μl酚和氯仿混合液,摇匀4~8min,静置4~8min;酚∶氯仿体积比20~30∶20~28。

7.如权利要求6所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤3)中,,加入600μl酚和氯仿混合液,酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24。

8.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤5)中,取600μl上清液,加入500~800μl异丙醇,摇匀2~4min,放置~20℃冰箱中,静置

20~40min。

9.如权利要求8所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤5)中,取600μl上清液,加入600μl异丙醇,摇匀3min,放置-20℃冰箱中,静置30min。

10.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤7)中,舍去上清液,留沉淀,加入75%的乙醇冲洗。

11.如权利要求10所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤7)中,75%的乙醇加入量为0.1~2ml。

12.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤9)中,弃上清液,将其放入超净工作台,风干10~20min。

13.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤10)中,加入30~50μl贮存液I,35~40℃作用12~18min。

14.如权利要求13所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法,其特征在于,步骤10)中,加入40μl贮存液I,37℃作用15min。