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专利号: 2015105045605
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:无效专利
更新日期:2025-11-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,包括前处理阶段和提取阶段,其特征在于,前处理阶段包括下列步骤:

1)取一份布满菌丝体的培养基,粗研,置一洁净容器中;

2)加入缓冲液I,至淹没过布满菌丝体的培养基,放置于摇床上,保持温度35℃~40℃,摇床转速100~150rpm摇动2~3h;缓冲液I:20mg/mL溶菌酶500μL+20mg/mL蛋白酶K 200μL+

0.02~0.1mmol/L pH 6.0~7.0PBS缓冲液配制成1000mL溶液;

3)取步骤2)的溶液,3000~4000rpm低速离心10~15min,溶液分成沉淀和上清液;收集上清液;

4)步骤3)中剩余的沉淀,加入缓冲液II洗涤,3000~4000rpm低速离心10~15min,取上清;洗涤过程重复2~5次,取每次洗涤后的上清液合并;缓冲液II:1mmol EDTA+10%SDS 

10mL+0.02~0.1mmol/L pH 6.0~7.0PBS缓冲液配制成100mL溶液;EDTA为乙二胺四乙酸;

SDS为十二烷基磺酸钠;

5)将步骤3)和步骤4)离心的上清液集中到一起,在转速10000~12000rpm,4℃离心10-

15min;弃上清液,收集沉淀。

2.如权利要求1所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,步骤2)中缓冲液I与培养基的体积比为(1.5:1)~(4:1)。

3.如权利要求1所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,步骤4)中缓冲液II与培养基的体积比为(1:3)~(1.5:1)。

4.如权利要求1~3任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,提取阶段包括下列步骤:

1)弃上清液,加入贮存液I;贮存液I:1mmol EDTA+10mmolTris-Hcl配制成100mL溶液;

EDTA为乙二胺四乙酸;Tris-Hcl为三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液;

2)放入30~45℃恒温水浴,保持0.5~2h;

3)加入贮存液II,置30~45℃恒温水浴中,保持0.5~2h;贮存液II:20mg/mL蛋白酶K 

20μL+10%SDS 10mL配制成100mL溶液;SDS为十二烷基磺酸钠;

4)加入贮存液III,混匀;贮存液III:5mol NaCl+0.1%CTAB 10mL配制成100mL溶液;

CTAB为十六烷基三甲基溴化铵;

5)加入高盐CTAB溶液,混匀;

6)50~60℃水浴80~100min;

7)加入酚/氯仿/异戊醇的混合溶液;8字混匀,5~20min;

8)10000~15000rpm,2~8℃离心5~20min;

9)取上清液,加入氯仿/异戊醇的混合液,8字混匀;

10)10000~15000rpm,2~8℃离心5~20min;

11)取上清液,加入700~900μL异丙醇,8字混匀;

12)10000~15000rpm,室温离心5~20min,弃上清液;

13)用乙醇吹洗2~5遍;

14)10000~15000rpm,室温离心2~8min;

15)弃上清液,晾干,加入贮存液I;

16)2~6℃冰箱中,溶解一夜;

17)-40~-10℃冰箱中保存。

5.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,贮存液I、贮存液II、贮存液III的体积比为(8~15):1:(1.5~3)。

6.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,贮存液I、贮存液II、贮存液III的体积比为(10~13):1:(1.7~2.5)。

7.如权利要求5~6任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,步骤5)中,加入60~100μL高盐CTAB溶液,混匀;步骤6)中,55℃水浴90min。

8.如权利要求5~6任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,步骤7)中,加入700~900μL酚/氯仿/异戊醇混合液;8字混匀,10min;酚∶氯仿∶异戊醇体积比(20~30):(20~28):1。

9.如权利要求8所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,步骤7)中,酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24∶1;加入800μL酚∶氯仿∶异戊醇混合液。

10.如权利要求5~6任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,步骤9)中,加入700~900μL氯仿/异戊醇混合液,8字混匀;氯仿∶异戊醇体积比20~30∶1。

11.如权利要求5~6任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,步骤11)中,加入700~900μL异丙醇,8字混匀。

12.如权利要求5~6任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,步骤13)中,用75%乙醇吹洗三遍。

13.如权利要求5~6任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,步骤14)中,12000rpm,室温离心5min。

14.如权利要求5~6任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法,其特征在于,步骤15)中,加入30μL贮存液I;步骤16)中,4℃冰箱中,溶解一夜。