1.一种检测拟南芥叶片细胞数目的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)植物叶片的酶解:取1片拟南芥叶片,剪切成长0.5-1.0mm、宽0.1-0.2mm的小块,然后加入叶片酶解液0.5-1mL,于20-22℃,30-40rpm黑暗酶解10-12小时,至叶片酶解完全;
2)细胞裂解与细胞核的收集:
将酶解完全的叶片酶解液过300-400目筛,然后以1400g-1500g离心10-12min,弃上清,加入溶液I溶解沉淀,将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次,直至沉淀完全溶解;然后将溶液于1400g-1500g离心10-12min,弃上清,向沉淀中加入预冷的细胞裂解缓冲液,再次将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次,直至混匀,冰浴5-10min后,
4℃1400g-1500g离心10-12min,弃上清,所得沉淀再次用预冷的细胞裂解缓冲液溶解,并重复上述步骤1-3次,直至沉淀呈灰黑色;
3)细胞核的染色与计数:
向上述呈灰黑色的沉淀中加入细胞裂解缓冲液,将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次,直至沉淀完全溶解,然后加入等体积的染液II,混匀,冰浴30-40min后,用孔径300-400目的尼龙膜过滤,用流式细胞仪检测滤液中细胞核数目,从而获得叶片细胞数目;
其中,步骤1)中所述叶片酶解液的配方为:1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、20mM KCl、pH5.7的20mM MES、0.4M甘露醇、10mMCaCl2、5mMβ-巯基乙醇和0.1%BSA,以水配制;
步骤2)中所述溶液I的配方为:pH5.8的0.03%MES、154mMNaCl、125mM CaCl2、5mM KCl和5mM葡萄糖,以水配制;
步骤2)和3)中所述细胞裂解缓冲液的配方为:15mM Tris、2mMNa2EDTA、0.5mM四盐酸精胺、80mM KCl、20mM NaCl、0.5%TritonX-100和15mMβ-巯基乙醇,pH7.5,以水配制;
步 骤3)中 所 述 染 液II 的 配 方 为:100μg/mL PI、100μg/mL RNase和 0.1 %TritonX-100,以磷酸缓冲液配制;所述磷酸缓冲液的配制方法为:取7.65g NaCl、0.725g Na2HPO4和0.212g KH2PO4,加入800mL水,调pH至7.4,然后定容至1L。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)植物叶片的酶解:取1片拟南芥叶片,剪切成长0.5-1.0mm、宽0.1-0.2mm的小块,然后加入叶片酶解液1mL,于22℃,30-40rpm黑暗酶解12小时,至叶片酶解完全;
2)细胞裂解与细胞核的收集:
将酶解完全的叶片酶解液过400目筛,然后以1500g离心10min,弃上清,加入溶液I溶解沉淀,将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次,直至沉淀完全溶解;然后将溶液于1500g离心10min,弃上清,向沉淀中加入预冷的细胞裂解缓冲液,再次将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次,直至混匀,冰浴5-10min后,4℃1500g离心10min,弃上清,所得沉淀再次用预冷的细胞裂解缓冲液溶解,并重复上述步骤1-3次,直至沉淀呈灰黑色;
3)细胞核的染色与计数:
向上述呈灰黑色的沉淀中加入细胞裂解缓冲液,将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次,直至沉淀完全溶解,然后加入等体积的染液II,混匀,冰浴30min后,用孔径
400目的尼龙膜过滤,用流式细胞仪检测滤液中细胞核数目,从而获得叶片细胞数目。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤1)中所述叶片酶解液的配制方法为:按比例称取纤维素酶、离析酶、KCl和甘露醇,加水溶解,然后向其中加入预先于70℃预热5min的MES,于55℃水浴加热10min,然后冷却至室温,加入CaCl2、β-巯基乙醇和BSA,混匀,即得。