1.一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、原料处理:利用蛹虫草培养基匀浆制得浆料或者制得干粉;
S2、利用所述浆料或干粉基于碱液提取法或酶提取法提取虫草多糖,获得虫草多糖提取液;其中酶提取法所用的酶为胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的一种或多种。
S3、对所述虫草多糖提取液基于中温淀粉酶清除淀粉,灭活分离,得上清液;具体为:向所述虫草多糖提取液加入水解液重量0.05~3.00%的中温淀粉酶,每500~1000mL提取液加入1~10%CaCl2溶液1~5mL,于50~75℃酶解1~2小时,而后在90~98℃条件下灭活5~10分钟,冷却后离心分离,获得上清液待用;
S4、将所述上清液真空浓缩至多糖含量为1.5~3.0%;
S5、向浓缩液中加入乙醇,至乙醇最终浓度75~80%,在0~4℃温度下,醇沉12~16小时;
S6、醇沉后,以3000~4000转/分钟离心分离,蒸干乙醇,得沉淀状蛹虫草粗多糖;
S7、通过下述a或b方法对蛹虫草粗多糖进行除蛋白及小分子,制备得到精制蛹虫草多糖:a. 所述沉淀状蛹虫草粗多糖配置成2~10%的溶液,在4℃条件下缓慢加入10%三氯乙酸溶液,体积比为5:1,搅拌;在4℃条件下振摇10分钟后,在4℃条件下高速离心10分钟,取上清液重复以上脱蛋白步骤数次,至多糖溶液中福林酚法检测蛋白含量为0.5%;
而后向溶液中加入4.5倍体积95%的乙醇醇沉12~16小时,高速离心,取沉淀,配成3~
5%的多糖液,在截留分子量为7000Da~8000Da的透析袋内透析48~72小时,透析后,袋内液浓缩,冷冻干燥得精制虫草多糖;
b. 所述沉淀状虫草粗多糖配置成2~10%的溶液,加入溶液重量的0.05~1%的胃蛋白酶,用6mol/L的HCl调pH 1.5~3.0,在37℃条件下酶解1~6小时;而后于90~
98℃灭酶10分钟,冷却至室温,用NaOH溶液调至中性,离心10分钟,取上清液,加入3~
4.5倍体积95%乙醇,在0~4℃的温度下,醇沉12~16小时;离心,取沉淀,配制成2~
5%的溶液,以体积比为4~5:1的比例加入氯仿与正丁醇体积比为4~5:1的Sevag试剂,剧烈振摇20分钟,静置30分钟,离心除去沉淀,取上清液重复以上脱蛋白步骤数次,至多糖溶液中福林酚法检测蛋白含量至0.5%;而后向溶液中加入4.5倍体积95%的乙醇醇沉12~16小时,高速离心,取沉淀,配成2~5%的多糖液,在截留分子量为7000Da的透析袋内透析48~72小时,透析后,袋内液浓缩,冷冻干燥得精制虫草多糖。
2.根据权利要求1所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法,其特征在于,所述碱液提取法实现步骤S2的具体步骤为: 向所述浆料或干粉中加入重量20~100倍的水,混匀,以0.5~1mol/L的NaOH或KOH调节pH值为8~9,在40~60℃下,浸提2~6小时后,
3000~4000转/分钟离心10~15分钟分离后的沉淀再加10~40倍的水,调节pH值8~
9,重复上述浸提、分离操作1~2次,合并所得上清液,调节pH至中性获得所述虫草多糖提取液。
3.根据权利要求1所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法,其特征在于,所述酶提取法实现S2的具体步骤为:向所述浆料或干粉中加入重量20~100倍的水;选用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的一种,用碱液或酸液调节pH值至所选用酶的适宜范围,加入酶搅拌酶解,酶解时保持pH值;
而后调pH为中性,于90~98℃下灭活5~10分钟,冷却后3000~4000转/分钟离心10~15分钟分离,所得沉淀加10~40倍水重复上述酶解、分离步骤1~2次,合并几次分离的上清液,即为所述虫草多糖提取液。
4.根据权利要求1所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法,其特征在于,所述酶提取法实现S2的具体步骤为:向所述浆料或干粉中加入重量20~100倍的水;选用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的一种,选用碱液或酸液调节pH值至所选用酶的适宜范围,加入所选的酶搅拌酶解,酶解时保持pH值;
再选用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的第二种,以碱液或酸液调节pH值至所述第二种酶的适宜范围,加入所述第二种酶搅拌酶解,酶解时保持pH值;
而后调pH为中性,于90~98℃下灭活5~10分钟,冷却后3000~4000转/分钟离心10~15分钟分离,所得沉淀加10~40倍水重复上述酶解、分离步骤1~2次,合并几次分离的上清液,即为所述虫草多糖提取液。
5.根据权利要求1所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法,其特征在于,所述酶提取法实现S2的具体步骤为:向所述浆料或干粉中加入重量20~100倍的水;选用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的2~3种,而且所述2~3种酶的适宜pH值和温度相近;
用碱液或酸液调节pH值至所选用酶的适宜范围,加入所述2~3种酶搅拌酶解,酶解时保持pH值;
而后调pH为中性,于90~98℃下灭活5~10分钟,冷却后3000~4000转/分钟离心10~15分钟分离,所得沉淀加10~40倍水重复上述酶解、分离步骤1~2次,合并几次分离的上清液,即为所述虫草多糖提取液。
6.根据权利要求3-5任一项所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法,其特征在于,在所述浆料或干粉加入重量20~100倍的水之后,首先在20~80℃浸提2~6小时,而后实施具体的酶法提取步骤。