1.海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法，其特征在于操作步骤为：

(1)海参处理

取新鲜活海参，去体壁后将海参肠清洗，去除泥沙和杂质；

(2)粗酶提取

将其用1～20倍海参肠体积的0℃的含5～200mmol/L L-Cys(L-半胱氨酸) 的5～200mmol/L pH 3.0～6.8的醋酸钠缓冲液匀浆破碎；在4℃下浸提4～18h， 6000～20000×g冷冻离心5～60min，取上层清液用选择好的硫酸铵饱和度进行 硫酸铵分级沉淀，后4℃下经6000～20000×g冷冻离心20～60min，取沉淀， 并用上述醋酸钠缓冲液溶解沉淀，透析除盐后浓缩，即得到组织蛋白酶B粗酶；

(3)酶的纯化

将得到的组织蛋白酶B粗酶用离子交换层析色谱、凝胶色谱和高效液相色 谱中的2～3种方法达到纯化的目的，其中离子交换层析色谱是必须使用的。

2.根据权利要求1所述海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法，其特征在 于步骤(2)粗酶提取中所述用选择好的硫酸铵饱和度进行硫酸铵分级沉淀是： 在不同的硫酸铵饱和度下使不同的蛋白质从溶液中沉淀析出，选择目的蛋白的 最大饱和度作为硫酸铵的最终饱和度；具体步骤是：取新鲜海参肠用5～ 200mmol/L pH 3.0～6.8的醋酸钠缓冲液浸提，匀浆捣碎后经冷冻离心5～ 60min，取上清液，平均分成6份后并在4℃和磁力搅拌下依次向上清液中加入 研磨后的硫酸铵，使其饱和度分别达到0％、20％、40％、60％、80％、90％， 静置4h后，冷冻离心20～60min，取上清液测定酶活力，选取酶活力最大所在 的硫酸铵饱和度作为分级沉淀的条件。

3.根据权利要求1所述海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法，其特征在 于步骤(3)酶的纯化中所述组织蛋白酶B粗酶用离子交换层析色谱进行纯化的 具体步骤为：采用DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析色谱柱，以含0.01～10 mmol/L的NaCl的5～200mmol/L L-Cys的pH5.0～6.5的磷酸钠缓冲液线性洗 脱，流速为0.5ml/min，将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓缩。

4.根据权利要求1所述海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法，其特征在 于步骤(3)酶的纯化中所述组织蛋白酶B粗酶用凝胶色谱进行纯化，可以采用 G-75凝胶层析柱或/和Sephacryl 100HR凝胶层析柱进行纯化，具体步骤为：均 采用含0.01～10mmol/L的NaCl的5～200mmol/L L-Cys的pH5.0～6.5的磷酸 钠缓冲液洗脱，流速为0.5ml/min，将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓缩。

5.根据权利要求1所述海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法，其特征在 于步骤(3)酶的纯化中所述组织蛋白酶B粗酶用高效液相色谱技术进行纯化是 采用TSK-3000SWxl凝胶色谱柱，用0.01～10mmol/L的Na2SO4洗脱，流速为 0.1～0.5ml/min，将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓缩。

6.根据权利要求1～5中任一项所述海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方 法，其特征在于所述的浓缩采用以下三种方法之一进行：(1)超滤浓缩法：

选择1000～10000分子量的超滤膜，将小分子蛋白和金属离子去除，达到 浓缩的目的；

(2)聚乙二醇浓缩法：

将所需浓缩的酶液装于分子量为10000的透析袋内后，置于4℃条件下的烧 杯中，向其中添加聚乙二醇，直到透析袋被覆盖，当透析袋内溶剂渗出即被聚 乙二醇迅速吸去，从而达到浓缩的目的；

(3)采用冷冻干燥技术：

将得到的粗酶冷冻干燥得到干粉，将干粉复溶于1～2ml浸提液中，形成溶 液，以达到浓缩的目的。