1.一种溶菌酶的制备方法,其特征在于是棘皮类溶菌酶的海参肠溶菌酶的制备方法,其工艺步骤为:(1)匀浆:海参肠用无离子水洗净、匀浆;
(2)浸提:用3~8倍体积Tris-HCl缓冲液溶液浸提,2~5℃下静置4~24h;4℃下10000g 10min离心,上清液既为含溶菌酶的粗酶液;
所述Tris-HCl缓冲液规格为:50mmol/L,pH 7.5,含0.1%~2%Triton X-114;
(3)浓缩:将粗酶液25℃~37℃水浴5~15min使水相与去垢剂相分层,25℃~37℃下2000g离心5~15min收集去垢剂相,即为含溶菌酶的浓缩液,4℃保存备用;
(4)透析:将浓缩液放入截留分子量为7000的透析袋中,然后将透析袋放入含5~10倍体积的pH=6.0~7.0、0.02mol/L~0.05mol/L磷酸盐缓冲液的容器内,4℃透析12~24h;
(5)纤维素柱吸附:沿柱壁加入经过透析的浓缩液,以1.0ml/min流速通过经pH=6.0~7.0、0.02~0.05mol/L磷酸盐缓冲液平衡过的CM52纤维素层析柱层析,再用3倍体积pH=6.0~7.0、0.02mol/L~0.05mol/L磷酸盐缓冲液洗涤层析柱,除去未吸附杂质;
(6)洗脱:分别用由pH=6.0~7.0、0.02mol/L~0.05mol/L磷酸盐缓冲液配制的含等差浓度的NaCl溶液,对吸附柱进行梯度洗脱,流速1.0mL/min,分别收集有酶活的组分合并,4℃保存;
所述NaCl溶液浓度分别为60、120、180、240、300、360、420、480、540mmol/L,溶液中均含0.1%TritonX-114;
(7)透析:将合并后的酶液放入截留分子量为7000的透析袋中,然后将透析袋放入含有分子量为8000的聚乙二醇的容器内,4℃透析,至袋中酶液为3~5ml,取袋中浓缩酶液4℃保存备用;
(8)凝胶柱吸附及洗脱:洗脱液再用经pH=6.0、0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex-G75层析柱凝胶过滤,120%柱体积的磷酸盐缓冲液洗脱,收集有酶活的组分;
(9)干燥:将含有溶菌酶的洗脱液冷冻干燥得溶菌酶纯品。
2.根据权利要求1所述的溶菌酶的提取方法,其特征在于在第(2)浸提步骤中,海参肠用搅拌机匀浆,再用5倍体积2%TritonX114溶液浸提,4℃静置过夜;4℃下10000g 10min离心。
3.根据权利要求1所述的溶菌酶的提取方法,其特征在于在第(8)凝胶柱吸附及洗脱步骤中,所述的Sephadex-G75层析柱为1.8cm×60cm的Sephadex-G75凝胶柱。
4.根据权利要求1所述的溶菌酶的提取方法,其特征在于在第(9)冷冻干燥步骤中,在合并有酶活的洗脱液,在-40℃冷冻0.5h~2h,接着在-70℃冷阱12h~24h,最后得到干燥的溶菌酶纯品。