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专利号: 2025111367629
申请人: 浙江理工大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-08-04
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于石蒜减数分裂细胞蛋白免疫荧光染色的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、获取石蒜减数分裂细胞:固定石蒜减数分裂时期花芽,分离花药并挤出花粉母细胞;

S2、两阶段酶解处理:

第一阶段:将花粉母细胞用葡聚糖酶液浸泡酶解;

第二阶段:经清洗后,再用混合酶液浸泡酶解;

所述混合酶液中的酶为细胞解旋酶、纤维素酶和果胶酶;

所述葡聚糖酶液的质量浓度为2.5%;

所述混合酶液的质量浓度为0.3%,溶解于10 mM,pH为4.5的柠檬酸缓冲液,其中,细胞解旋酶、纤维素酶和果胶酶的比例为1∶1∶1;

S3、酶解后的细胞涂片固定;

S4、依次孵育一抗和荧光标记二抗;

S5、封片后荧光显微镜观察。

2.根据权利要求1所述基于石蒜减数分裂细胞蛋白免疫荧光染色的方法,其特征在于,所述石蒜选自海滨石蒜、春晓石蒜或忽地笑。

3.根据权利要求1所述基于石蒜减数分裂细胞蛋白免疫荧光染色的方法,其特征在于,步骤S1中,固定石蒜减数分裂时期花芽的固定液为卡诺氏固定液;所述卡诺氏固定液成分为:无水乙醇和乙酸按体积比3∶1配制;固定的时间≥24h;

所述减数分裂时期为第一次减数分裂时期或第二次减数分裂时期。

4.根据权利要求1所述基于石蒜减数分裂细胞蛋白免疫荧光染色的方法,其特征在于,步骤S2中,用葡聚糖酶液浸泡酶解的时间不低于1h,使用混合酶液浸泡酶解的时间不低于

4h。

5.根据权利要求4所述基于石蒜减数分裂细胞蛋白免疫荧光染色的方法,其特征在于,用葡聚糖酶液浸泡酶解的时间为1.5h,使用混合酶液浸泡酶解的时间为5h。

6.根据权利要求1所述基于石蒜减数分裂细胞蛋白免疫荧光染色的方法,其特征在于,步骤S3中,酶解后的细胞涂片固定时,先向酶解后的细胞滴加水并碾压,再加入10‑20 μL 

60%乙酸溶液混匀涂片,干燥固定后标记位置。

7.根据权利要求1所述基于石蒜减数分裂细胞蛋白免疫荧光染色的方法,其特征在于,步骤S4孵育前还包括将固定样片使用柠檬酸盐缓冲液微波处理,之后浸泡3‑5min;

浸泡后将样片用缓冲液1避光浸泡1h;所述缓冲液1为1mL Triton X‑100溶于100mL 10×PBS缓冲液,加水定容至1L配制而成,pH=7.4。

8.根据权利要求7所述基于石蒜减数分裂细胞蛋白免疫荧光染色的方法,其特征在于,使用10 mM柠檬酸盐溶液,微波处理时的火力为50p,微波处理加热至90‑100℃。

9.根据权利要求1所述基于石蒜减数分裂细胞蛋白免疫荧光染色的方法,其特征在于,步骤S4中,所述一抗为即用型山羊血清一抗,4℃避光孵育≥48h;

所述荧光标记二抗为即用型山羊血清荧光标记二抗,37℃避光孵育≥70min。

10.根据权利要求9所述基于石蒜减数分裂细胞蛋白免疫荧光染色的方法,其特征在于,孵育一抗后用缓冲液2洗涤;所述缓冲液2为1 mL Tween‑20溶于100 mL 10×PBS缓冲液,加水定容至1 L配制而成,pH=7.4。