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专利号: 2025105138482
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体,其特征在于,所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO:

3所示。

2.一种含权利要求1所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体编码基因的重组基因工程菌。

3.一种权利要求1所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体在催化甾体化合物C1,2位脱氢中的应用,其特征在于,所述应用是催化(16α)‑甲基雄甾‑4,9‑二烯‑3,17‑二酮合成(16α)‑16‑甲基雄甾‑1,4,9(11)‑三烯‑3,17‑二酮。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述应用的方法为:以含3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体编码基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或所述湿菌体经超声破碎提取的粗酶液为催化剂,以甾体化合物(16α)‑甲基雄甾‑4,9‑二烯‑3,17‑二酮为底物,以吩嗪硫酸甲酯为质子受体,以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅酶,加入助溶剂,以pH6‑10的缓冲液为反应介质构建反应体系,在25‑45 ℃、180 rpm条件下反应48‑120 h,得到脱氢化合物(16α)‑

16‑甲基雄甾‑1,4,9(11)‑三烯‑3,17‑二酮的反应液;所述助溶剂为β‑环糊精、甲醇、乙醇、异丙醇或吐温‑80。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,缓冲液为pH 8.0、50 mM 的Tris‑HCl缓冲液。

6.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述反应体系中,底物加入终浓度为5‑25 g/L,吩嗪硫酸甲酯加入终浓度为1 mM,辅酶加入终浓度为0.2 mM,催化剂的用量以湿菌体的质量计为10‑30 g/L;助溶剂体积加入浓度5‑15 %。

7.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述助溶剂为吐温‑80。

8.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述催化剂按如下方法制备:

将含3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种至含50 mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,37 ℃、180 rpm培养过夜,获得种子液;以体积浓度3 %的接种量将种子液接种至含50 mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,37 ℃、180 rpm培养至OD600为

0.6‑0.8,加入终浓度为0.1 mM的IPTG,25 ℃、180 rpm诱导培养16 h,获得发酵液;发酵液经8000 rpm、4 ℃离心10 min,所得菌体沉淀用生理盐水重悬后,8000 rpm、4 ℃离心10 min,收集湿菌体;将湿菌体按80g/L的量用50 mM、pH8.0的Tris‑HCl缓冲液重悬,重悬液于冰上放置30 min后,在超声功率360 W下超声10 min,超声3 s,间歇7 s,超声后的破碎液经

8000 rpm、4 ℃离心10 min后弃去沉淀,所得上清即为粗酶液。