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专利号: 2024109987510
申请人: 苏州方格尔生物科技有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于拉曼增强光谱的大肠杆菌检测试剂,其特征在于,其通过以下方法制备得到:S1、制备Fe3O4磁性微球;

S2、制备二氧化硅包覆磁性微球;

S3、在二氧化硅包覆磁性微球上接枝铜掺杂还原型碳点;

S4、原位沉积金纳米颗粒,制备金纳米颗粒修饰的磁性微球;

S5、在金纳米颗粒修饰的磁性微球上接枝大肠杆菌适配体,得到所述大肠杆菌检测试剂;

进行检测时,将该检测试剂与待测样品混合孵育,然后进行拉曼检测,根据与大肠杆菌对应的拉曼特征峰的有无及强度,实现待测样品中大肠杆菌的定性和定量检测;

步骤S1具体为:

取5.0‑21.6g六水合三氯化铁和6‑24g四水合二氯化铁加入200‑500mL去离子水中,加入6.5‑18g聚乙二醇,超声分散15‑60min,然后加入50‑200mL浓度为2‑6mol/L的氢氧化钠溶液,氮气保护、60℃下搅拌反应0.5‑3h,磁铁分离出磁性产物,去离子水洗涤至中性,60‑80℃下真空干燥至恒重,得到Fe3O4磁性微球;

步骤S2具体为:

S2‑1、取1‑4g Fe3O4磁性微球加入100‑400mL乙醇中,超声分散5‑30min,然后加入4‑

16mL浓度为10‑20wt%的氨水,再加入1.75‑7g乙烯基三乙氧基硅烷,70‑80℃下搅拌回流4‑

16h,磁吸分离,磁性产物用乙醇洗涤,得到预处理磁性微球;

S2‑2、取1‑4g预处理磁性微球加入由75‑300mL乙醇和50‑200mL去离子水组成的混合溶液中,超声分散5‑30min,然后加入3.5‑13mL浓度为10‑20wt%的氨水,再于搅拌下滴加1.1‑

4.4ml硅酸四乙酯,30‑45℃、200‑800rpm下搅拌反应2.5‑10h,磁吸分离,磁性产物用乙醇洗涤,得到二氧化硅包覆磁性微球:SiO2@Fe3O4;

步骤S3具体为:

S3‑1、取1g二氧化硅包覆磁性微球、0.6g醋酸铜加入100mL去离子水中,超声分散

20min,得到混合液A;

S3‑2、取960mg柠檬酸、316mg吡啶、264mg维生素C和105mg半胱氨酸加入由80mL去离子水和60mL乙醇组成的溶液中,超声分散10min,得到混合液B;

S3‑3、将混合液B加入混合液A中,超声分散45min,所得前驱液转移至聚四氟乙烯内衬的反应釜中,190℃下反应8h,反应结束后冷却至室温,离心过滤,固体产物用去离子水洗涤,75℃下真空干燥12h,得到接枝改性磁性微球:CDs‑Cu@SiO2@Fe3O4;

步骤S4具体为:

取0.5‑2g接枝改性磁性微球加入50‑200mL去离子水中,超声分散15‑60min,得到微球分散液;向微球分散液中加入5‑20mL浓度为0.075g/mL的HAuCl4溶液,300‑800rpm、60‑80℃下搅拌反应1‑4h,过滤,固体产物用乙醇洗涤,50‑70℃下真空干燥4‑12h,得到金纳米颗粒修饰的磁性微球:AuNPS‑CDs‑Cu@SiO2@Fe3O4。

2.根据权利要求1所述的基于拉曼增强光谱的大肠杆菌检测试剂,其特征在于,步骤S5具体为:S5‑1、将0.1g金纳米颗粒修饰的磁性微球加入20‑80mL去离子水中,超声分散10‑

30min,得到载体液;

S5‑2、取10‑40μL浓度为12‑50μM的大肠杆菌适配体溶液、50‑200μL载体液加入到4‑

16mL浓度为2‑10mM pH为7.0的PBS溶液中,超声分散5‑20min,室温下孵育30‑90min,磁吸分离,磁性产物用去离子水洗涤,冷冻干燥,得到大肠杆菌检测试剂:APT‑AuNPS‑CDs‑Cu@SiO2@Fe3O4。

3.根据权利要求2所述的基于拉曼增强光谱的大肠杆菌检测试剂,其特征在于,大肠杆菌适配体的5’端修饰有巯基,具体序列如SEQ ID NO:1所示:

5’‑SH‑AAAAAATCCGTCACACCTGCTCTATCAAATGTGCAGATATCA AGACGATTTGTACAAGATGG‑3’。

4.一种基于拉曼增强光谱的大肠杆菌检测方法,其特征在于,包括以下步骤:用去离子水将权利要求1‑3中任意一项所述的检测试剂配制成浓度为0.1‑5mg/mL的分散液,然后与待测样品混合,室温下孵育5‑15min,用磁铁分离出磁性物质,去离子水洗涤,然后重新分散于去离子水中,得到检测样品,吸取检测样品滴加在洁净的硅片上,进行拉曼检测;根据获得的拉曼图谱进行大肠杆菌的定性和定量分析;

定性分析方法为:拉曼图谱中存在与目标真菌对应的拉曼特征峰时,判断待测样品中含有大肠杆菌;

定量分析方法为:根据大肠杆菌对应的拉曼特征峰的强度,结合预先构建的表征拉曼特征峰强度与大肠杆菌浓度关系的标准曲线计算得到待测样品中大肠杆菌的浓度。

5.根据权利要求4所述的基于拉曼增强光谱的大肠杆菌检测方法,其特征在于,拉曼特‑1征峰位置选自718、965、1138、1266、1455和1585cm 中的至少一个。

6.一种大肠杆菌检测试剂盒,其特征在于,其包括如权利要求1‑4中任意一项所述的检测试剂。