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专利号: 2024106009361
申请人: 江苏海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种蛋白酶基因VSP2V‑280,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种如权利要求1所述的蛋白酶基因VSP2V‑280编码的蛋白,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种如权利要求1所述的蛋白酶的生产方法,其特征在于,具体步骤如下:步骤1:以XhoⅠ和SacⅠ为酶切位点,将蛋白酶基因VSP2V‑280与pCold I载体连接;

步骤2:将步骤1的连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞,冰浴30min,42℃水浴热激

70s,快速冰浴2‑30min,加入600μL无抗生素的LB液体培养基,混匀37℃,180rpm培养1‑

1.5h,取菌液100μL涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB‑Amp固体培养基上,37℃培养12‑

15h;

步骤3:挑取单菌落接种含LB‑Amp固体培养基,37℃培养6‑8h,使用Taq PCR MasterMix扩增目的基因VSP2V‑280;

步骤4:提取质粒并将提取的质粒转化E.coli BL21感受态细胞,冰浴30min,放置42℃水浴锅60‑90s,立刻转置冰面2min,加入600μL无抗生素的LB液体培养基,恒温摇床,37℃,

150r/min培养1.5h;

步骤5:取菌液100μL涂布于LB‑Amp固体培养基上,37℃培养12~14h,取单菌落接种于LB‑Amp液体培养基中,37℃180r/min培养4~6h,OD600nm为0.8时,按4%接种量将菌液接种至LB‑Amp液体培养基中,37℃180r/min培养4‑5h,OD600nm为0.5时,加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷,温度为15℃,发酵24h;

步骤6:将培养好的菌液8000r/min离心15min,弃上清,将沉淀菌体使用PBS缓冲液重悬菌体,超声破碎30min,8000r/min离心10min,上清液为粗酶液,测定酶活力。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的LB液体培养基的组成为:0.5%质量分数的酵母粉,1%质量分数的胰蛋白胨,1%质量分数的NaCl,LB液体培养基的pH 7.4。

5.一种如权利要求2所述的具有氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白酶在水解小清蛋白上的应用,其特征在于,所述小清蛋白来源于草鱼、黄颡鱼、鳊鱼或鲫鱼。