1.一种应用于反刍厚毛虫体外培养的培养基,其特征在于,所述培养基按体积百分比由如下组分制成:胎牛血清3~5%、马血清5%、半胱氨酸盐酸盐溶液2%、双抗溶液2%、蔗糖溶液2~4%和厌氧SP盐溶液82%~86%;
所述厌氧SP盐溶液按质量体积百分比由如下组分制成:三水合磷酸氢二钾0.55%、磷酸二氢钾0.4%、七水合硫酸镁0.007%、氯化钠0.05%、氯化钙0.004%、碳酸氢钠0.6%、剩余为蒸馏水,并充入二氧化碳;
所述质量体积百分比中质量单位用g时,体积单位用mL。
2.根据权利要求1所述的应用于反刍厚毛虫体外培养的培养基,其特征在于,所述的厌氧SP盐溶液的配制方法如下:①称取三水合磷酸氢二钾5.5g、磷酸二氢钾4.0g、七水合硫酸镁0.07g、氯化钠0.5g,加入蒸馏水定容至800mL,制得溶液A;
②称取氯化钙0.04g,加入蒸馏水定容至100mL,制得溶液B;
③称取碳酸氢钠6.0g,加入蒸馏水定容至100mL,制得溶液C;
④分别将溶液A、溶液B和溶液C高温高压灭菌,灭菌后常温保存备用;
⑤使用前将溶液A、溶液B和溶液C混合摇匀,充入二氧化碳,得到厌氧SP盐溶液,密封备用。
3.根据权利要求1所述的应用于反刍厚毛虫体外培养的培养基,其特征在于,每10mL所述的双抗溶液含有:青霉素G钠300mg、硫酸链霉素250mg、剩余为蒸馏水;每10mL所述的蔗糖溶液含有:蔗糖500mg,剩余为蒸馏水;每10mL所述的半胱氨酸盐酸盐溶液含有:半胱氨酸盐酸盐1g,剩余为蒸馏水。
4.根据权利要求2所述的应用于反刍厚毛虫体外培养的培养基,其特征在于,步骤④所述的灭菌温度为121℃,灭菌时间为20min。
5.根据权利要求2所述的应用于反刍厚毛虫体外培养的培养基,其特征在于,步骤⑤所述的充入二氧化碳的时长为5min,以排尽培养基中的氧气,并使其pH值降至6.5~7.0。
6.一种权利要求1~5任一项所述的应用于反刍厚毛虫体外培养的培养基的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:准备厌氧培养瓶,向其中添加胎牛血清300~500μL、马血清500μL、半胱氨酸盐酸盐溶液200μL、双抗溶液200μL、蔗糖溶液200~400μL和厌氧SP盐溶液8.2~8.6mL,向培养瓶内充入二氧化碳后立即盖紧瓶塞,置于39℃下备用。
7.根据权利要求6所述的应用于反刍厚毛虫体外培养的培养基的制备方法,其特征在于,向培养瓶内充入二氧化碳的时长为5~10秒;所述的二氧化碳纯度大于99.99%。
8.一种应用于反刍厚毛虫的体外培养方法,其特征在于,包括如下步骤:
a)准备多个厌氧瓶,每个厌氧瓶中加入权利要求1~5中任一项所述的反刍厚毛虫体外培养的培养基;
b)使用灭菌的瘤胃液采集导管采集瘤胃液,使用双层纱布过滤收集瘤胃液,密封,39℃保温速送至实验室后,转移至分液漏斗中并充入二氧化碳3~5分钟,置于39℃培养箱静置
30~60分钟后,收集沉降至漏斗底部的纤毛虫至装有厌氧SP盐溶液的小烧杯中,得到混合种瘤胃纤毛虫富集液;后先后使用两种密度尼龙滤网过滤混合种瘤胃纤毛虫富集液,将两次过滤后截留的反刍厚毛虫富集到厌氧SP盐溶液中获得反刍厚毛虫富集液,置于39℃保温备用;
c)向步骤b)中获得的反刍厚毛虫富集液中添加厌氧SP盐溶液,调整反刍厚毛虫的密度至2,500~5,000个/mL获得接种液,使用移液枪吸取接种液至步骤a)中所准备的培养基中,使初始培养密度为500~1,000个/mL,充入二氧化碳5~10秒后放入摇床中培养;
d)培养24h后在培养基中添加100~200μL蔗糖溶液,再培养24h后暂停摇床30~60min,使反刍厚毛虫沉降至培养瓶底部,使用新鲜培养基更换50%原培养基,充二氧化碳5~10秒后立即盖紧瓶塞并放回摇床中继续培养,如此循环往复,使虫体持续增殖。
9.根据权利要求8所述的应用于反刍厚毛虫的体外培养方法,其特征在于,步骤b)、c)和d)所述的二氧化碳纯度大于99.99%。
10.根据权利要求8所述的应用于反刍厚毛虫的体外培养方法,其特征在于,步骤c)和d)所述的摇床转速为150rpm。