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专利号: 2023109911288
申请人: 大连工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法,其特征在于,包括如下步骤:

S1、黑果腺肋花楸无菌苗的制备:取黑果腺肋花楸的幼嫩枝条作为外植体,剪去叶片,清水冲洗、剪切成茎段,经酒精、升汞溶液浸泡后用无菌水清洗,切成茎芽顶端向上,以每

100mL接种4~6根的接种比例接入快繁苗培养基中培养,得到黑果腺肋花楸无菌苗;所述快繁苗培养基是由MS培养基为基础培养基加入0.2mg/L NAA,0.8mg/L 6‑BA,30g/L蔗糖,7g/L琼脂组成的固体培养基;

S2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导和增殖:将所得黑果腺肋花楸无菌苗的叶片剪切后以每60mL接种3~5个的接种比例平铺在诱导不定根培养基中,温度为24~26℃,暗培养24~26d后,在光照强度为1500~3000lx,照光时间为12~18h/d,蓝红光光照波长比为(3~7):1,光照培养7~9d,得到黑果腺肋花楸不定根;所述诱导不定根培养基是由1/2MS培养基中加入1~3mg/L NAA,1~4mg/LIBA,30g/L蔗糖,4.5g/L琼脂组成的固体培养基;

S3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养:无菌条件下,将所得黑果腺肋花楸不定根剪切成不定根段后,以每120~130mL接种4~6个的接种比例接种于液体培养基悬浮培养;所述液体培养基是由1/2MS培养基中加入2.0~3.0mg/L NAA,1~3mg/L IBA,50g/L蔗糖组成;

S4、提高不定根悬浮培养的花青素含量:无菌条件下,将悬浮培养后的不定根切成0.45~0.55cm的切段,以每1000mL接种15~20个的接种比例转移到新鲜培养基中,灭菌后加入

1%乙烯利的磷酸二氢钾水溶液,温度为22~28℃,光照1500~3000lx,光质为蓝红波长比为(7:1)~(3:1)的条件下,光照培养25~35d;所述新鲜培养基由1/2MS、鲜重15g/L橘皮提取液,2.0~3.0mg/L NAA,1~3mg/LIBA,50g/L蔗糖组成。

2.根据权利要求1所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法,其特征在于,步骤S1所述清水冲洗次数为3~5次,所述茎段长度为3~5cm,所述无菌水冲洗次数为3~5次,所述茎芽为0.5~2.0cm的单芽;所述酒精浓度为70%,体积为190~210mL,浸泡时间为30~

60s;所述升汞溶液浓度为0.1%,体积为95~110mL,浸泡时间为10~15min;所述快繁苗培养基培养条件是温度为24~26℃,调节pH为7,LED全色光,光照强度为1200Lux、照光时长为

12~16h/d,培育40d。

3.根据权利要求1所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法,其特征在于,步骤S2所述剪切伤口个数为4~5个,剪切方式为沿着主叶脉竖直方向剪开、伤口宽度为叶片宽度的60%~70%,向阳面朝上摆放。

4.根据权利要求1所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法,其特征在于,步骤S3所述不定根段每段重量0.09~0.11g;所述悬浮培养是在温度为25~28℃、转速为95~

105rpm/min的条件下暗培养,培养周期为30~40d。

5.根据权利要求1所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法,其特征在于,步骤S4所述灭菌的方式为在110KPa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌,时间为25min;所述1%乙烯利的磷酸二氢钾水溶液是0.5g/L KH2PO4、1g/L 1%乙烯利溶于蒸馏水制得的,所述1%乙烯利的磷酸二氢钾水溶液是在灭菌后40~50min琼脂未凝的状态下添加的,添加量为200~

600μg/L。

6.根据权利要求1所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法,其特征在于,所述橘皮提取液是将新鲜橘皮捣碎,转速为5000rpm,离心10min,取上清液制得的。

7.根据权利要求1~6任一所述诱导黑果腺肋花楸不定根产生花青素的方法,其特征在于,包括如下步骤:S1、黑果腺肋花楸无菌苗的诱导:取黑果腺肋花楸的幼嫩枝条做外植体,剪去叶片,清水冲洗3次、将茎段剪成5cm的材料,经70%的酒精中浸泡30~60s后,再在0.1%升汞中浸泡

10min,用无菌水清洗3次,切成1cm的单芽,调节快繁苗培养基的pH调节至7并将单芽顶端向上接入100mL快繁苗培养基中,每瓶中接入5个单芽,在25℃的条件下,光照强度为1200Lux,LED全色光照光12h/d,培育40d,黑果腺肋花楸无菌苗,备用;

S2、黑果腺肋花楸无菌苗的不定根诱导和增殖:在无菌条件下,取步骤S1所得黑果腺肋花楸无菌苗叶片,沿着主叶脉竖直方向剪切出4个宽度为叶片宽度的2/3的伤口,取4个叶片向阳面朝上平铺在60mL诱导不定根培养基中,温度为25℃,暗培养25d后,进行光照培养,光照强度为3000Lux,光照培养8d,照光时间为12h/d,蓝红光光照波长比为5:1,得到黑果腺肋花楸不定根;

S3、黑果腺肋花楸的不定根悬浮培养:无菌条件下,将步骤S2中不同光质照射下培养出的黑果腺肋花楸不定根剪切成质量为0.1g的不定根段,取5段分别接种于125mL液体培养基中悬浮培养,所述悬浮培养是在温度为27℃、转速为100rpm/min的条件下暗培养,培养周期为35d;

S4、提高不定根悬浮培养的花青素含量:无菌条件下,将步骤S3培养后的不定根切成

0.5cm的切段,取5段转移到250mL新鲜培养基中,在110KPa、121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌

25min后,等待45min,向没有完全冷却、琼脂未凝的状态下新鲜培养基中加入添加400μg/L 

1%乙烯利的磷酸二氢钾水溶液,温度为25℃,光照强度为3000lx,光质为蓝红波长比为5:1的条件下,光照培养30d。