1.一种水产用异养硝化细菌制剂,其特征在于,该菌剂中含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JHD‑Z1与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JHD‑Z2;所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JHD‑Z1的生物保藏号为CCTCC NO:M 20221913;所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JHD‑Z2的生物保藏号为CCTCC NO:M 20221914。
2.根据权利要求1所述的水产用异养硝化细菌制剂,其特征在于,水产用异养硝化细菌
8 9
制剂中,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JHD‑Z1的活菌总数为x,且1×10≤x≤1×10;
8 9
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JHD‑Z2的活菌总数为y,且1×10≤y≤1×10。
3.根据权利要求1所述的水产用异养硝化细菌制剂,其特征在于,所述水产用异养硝化细菌制剂中,枯草芽孢杆菌JHD‑Z1、地衣芽孢杆菌JHD‑Z2二者的重量比为1∶1-3。
4.根据权利要求1所述的水产用异养硝化细菌制剂,其特征在于,所述水产用异养硝化细菌制剂中还包括可接受的营养型稀释载体。
5.根据权利要求4所述的水产用异养硝化细菌制剂,其特征在于,所述营养型稀释载体选自蔗糖、NaCl、MgSO4·7H2O、K2HPO4中的一种或者多种。
6.一种如权利要求1所述水产用异养硝化细菌制剂的制备方法,其特征在于,其步骤如下:将枯草芽孢杆菌JHD‑Z1、地衣芽孢杆菌JHD‑Z2采用牛津杯的方式进行菌株间的相互拮抗测试,产生拮抗作用的菌株不进行混合培养;将菌株按照同比例的方式进行混合培养12
7 7
h,用比浊仪测定菌液浓度并将菌液浓度调整至4.5×10 ‑4.8×10 CFU/mL的水平内;按1%的添加量接种于硝化细菌、亚硝化细菌液体培养基中,温度30℃、转速180 r/min、pH8、C/N15振荡培养96 h;每48 h取样一次,测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化;
硝化细菌液体培养基:NaNO2 0.0375 g,CH3COONa 5 g,NaCl 1.0 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,K2HPO4 1.0 g,蒸馏水1000 mL;
亚硝化细菌液体培养基:NH4Cl 4g,CH3COONa 5g,维氏盐溶液50 mL,蒸馏水1000 mL,pH
7.5‑8.0;
维氏盐溶液:K2HPO4 5 g,MgSO4·7H2O 2.5 g,NaCl 2.5 g,FeSO4·7H2O 0.05 g,MnSO4·4H2O 0.05 g,蒸馏水1000 mL;
氨氮的测定方法采用水杨酸分光光度法,亚硝酸盐氮的测定方法采用N‑(1‑萘基)二乙胺光度法;
7 8 9
将10、10 、10 CFU/mL作为不同的菌液浓度,按1%的添加量接种于硝化细菌、亚硝化细菌液体培养基中,温度30℃、转速180 r/min、pH8、C/N15振荡培养96 h;在0、12、24、48、96 h各取样一次,测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化,确定最佳菌液浓度;
将乙酸钠、蔗糖、丁二酸钠、柠檬酸钠作为唯一碳源,根据步骤(2)数据确定最佳的菌液添加浓度,温度30℃、转速180 r/min、pH8、C/N15振荡培养12 h,每3 h取样一次,测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化,确定最佳碳源;
(4)将C/N设置为10、15、20、25,根据步骤(2)、步骤(3)数据确定最佳菌液浓度和碳源,温度30℃、转速180 r/min、pH8振荡培养12 h,每3 h取样一次,测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化,确定最佳C/N;
(5)将1%、2%、5%、10%作为菌液接种量,按步骤(2)至步骤(4)得到的最佳菌液添加浓度、最佳碳源和最佳C/N按不同的接种量接种至液体培养基中,温度30℃、转速180 r/min、pH8,振荡培养12 h,每3 h取样一次,测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化,确定最佳菌液接种量;
(6)将培养基初始pH通过向培养基中添加HCl和NaOH溶液调节后设置为7、8、9、10,按步骤(2)至步骤(5)得到的最佳菌液添加浓度、最佳碳源、最佳C/N和最佳接种量接种至液体培养基中,温度30℃、转速180 r/min,振荡培养12 h,每3 h取样一次,测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化,确定最佳初始pH;
(7)将25℃、30℃、35℃、40℃设置为培养温度,按步骤(2)至步骤(6)得到的最佳菌液添加浓度、最佳碳源、最佳C/N、最佳接种量及最佳pH接种至液体培养基中,180 r/min,振荡培养12 h,每3 h取样一次,测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化,确定最佳培养温度;
(8)将步骤(2)至(7)得到的最终发酵液分别经8000 rpm,10 min离心收集菌体,向菌体中分别按照菌体与保护剂溶液重量比为菌体重量:保护剂重量=1:(5‑10)的比例向菌体中添加保护剂溶液,混匀获得菌悬液,将所述菌悬液冷冻干燥,得到复合异养硝化细菌菌剂;
所述保护剂溶液包括以下组分:脱脂乳粉25‑35g/L,脱盐乳清粉15‑30g/L,工业海藻糖
10‑20g/L,维生素C3‑4g/L,卵磷脂0.04‑0.08g/L,余量为蒸馏水。
7.权利要求1-5中任何一项所述水产用复合异养硝化细菌制剂或者权利要求6所述方法制得的水产用异养硝化细菌制剂的用途,其特征在于,所述的用途为降低养殖用水的氨氮与/或亚硝酸盐含量,改善水质。
8.权利要求1-5中任何一项所述水产用复合异养硝化细菌制剂或者权利要求6所述方法制得的水产用异养硝化细菌制剂的用途,其特征在于,所述的用途为提高养殖动物生长性能。