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专利号: 2023100003973
申请人: 福建省农业科学院植物保护研究所
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-27
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种区分苯醚甲环唑敏感型和抗药型玉米大斑病菌菌株的组合物,其特征在于,所述组合物中的标志物包括7‑甲基鸟苷、肌苷、5‑(2‑羟乙基)‑4‑甲基噻唑、11,12‑二羟基‑

5Z,8Z,14Z二十碳三烯酸、9S‑羟基‑10E,12Z,15Z‑十八碳三烯酸、前列腺素B1、L‑丙氨酰‑γ‑D‑谷氨酰‑L‑赖氨酸、壳二糖和4‑羟基他莫昔芬。

2.一种区分苯醚甲环唑敏感型和抗药型玉米大斑病菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:对待测玉米大斑病菌菌株进行培养;

对所述培养得到的玉米大斑病菌菌丝进行提取,得到菌丝提取物;

UPLC‑MS检测所述菌丝提取物中权利要求1所述组合物中的标志物组分,得到各个标志物组分的峰面积;

所述7‑甲基鸟苷、肌苷、5‑(2‑羟乙基)‑4‑甲基噻唑和11,12‑二羟基‑5Z,8Z,14Z二十碳三烯酸的检测于所述培养46~50h取样提取;

所述9S‑羟基‑10E,12Z,15Z‑十八碳三烯酸和前列腺素B1的检测在所述培养70~73h取样提取;

所述L‑丙氨酰‑γ‑D‑谷氨酰‑L‑赖氨酸、壳二糖和4‑羟基他莫昔芬的检测于所述培养

118~122h取样提取;

以预定的苯醚甲环唑敏感型玉米大斑病菌菌株各个培养时间段菌丝中权利要求1所述组合物中各标志物组分的UPLC‑MS检测峰面积为基准,苯醚甲环唑敏感菌株的UPLC‑MS检测各个标志物峰面积与待测玉米大斑病菌菌株的对应标志物峰面积比值结果大于1时则代表对应标志物显著上调表达;比值结果小于1时则代表对应标志物显著下调表达;

若7‑甲基鸟苷、肌苷、9S‑羟基‑10E,12Z,15Z‑十八碳三烯酸、L‑丙氨酰‑γ‑D‑谷氨酰‑L‑赖氨酸下调表达且5‑(2‑羟乙基)‑4‑甲基噻唑和11,12‑二羟基‑5Z,8Z,14Z二十碳三烯酸、前列腺素B1、壳二糖和4‑羟基他莫昔芬上调表达,则判定待测玉米大斑病菌菌株为苯醚甲环唑抗药菌株;

否则,则判定待测玉米大斑病菌菌株为苯醚甲环唑敏感菌株。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述培养应用的培养基包括PDA液体培养基;所述培养的温度为23~27℃,转速为160~200r/min。

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述菌丝提取物的提取包括如下步骤:对所述玉米大斑病菌丝进行液氮研磨得到菌丝粉;

将所述菌丝粉和体积浓度为50%的甲醇水溶液混合,进行湿磨提取,固液分离得到上清液;对所述上清液浓缩,得到浓缩物;对所述浓缩物复溶、过滤后得到菌丝提取物。

5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述湿磨的磨球为玻璃珠,所述菌丝粉、甲醇水溶液和玻璃珠的质量体积比为60~62mg:1~1.5mL:100~105mg。

6.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于,所述湿磨的功率为55Hz,所述湿磨的次数为2~3次,所述湿磨的时间为2~3min/次。

7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述复溶时应用的溶液为2‑氯‑L‑苯丙氨酸‑甲醇‑水溶液,所述2‑氯‑L‑苯丙氨酸‑甲醇‑水溶液中2‑氯‑L‑苯丙氨酸的质量浓度为

4.0μg/mL。

8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述UPLC‑MS检测中液相色谱单元的色谱柱为规格为2.1×150mm,1.8μm;柱温为40℃;进样量为2μL;

所述UPLC的正离子模式的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为体积浓度

0.1%甲酸乙腈溶液,所述流动相B为体积浓度0.1%的甲酸水溶液;梯度洗脱程序:0~

1min,2%甲酸乙腈;1~9min,2%~50%甲酸乙腈;9~12min,50%~98%甲酸乙腈;12~

13.5min,98%甲酸乙腈;13.5~14min,98%~2%甲酸乙腈;14~20min,2%甲酸乙腈;流速为0.25mL/min;

所述UPLC的负离子模式的流动相包括流动相C和流动相D,所述流动相C为乙腈,所述流动相D为5mM甲酸铵水;梯度洗脱程序:0~1min,2%乙腈;1~9min,2%~50%乙腈;9~

12min,50%~98%乙腈;12~13.5min,98%乙腈;13.5~14min,98%~2%乙腈;14~

17min,2%乙腈;流速为0.25mL/min;所述UPLC‑MS检测中质谱单元采用Q Exactive型质谱仪;电喷雾离子源为正负离子模式分别采集数据,正离子喷雾电压为3.50kV,负离子喷雾电压为‑2.50kV,鞘气30arb,辅助气10arb;毛细管温度325℃,以分辨率70000进行一级全扫描,一级离子扫描质荷比范围81~1000,采用HCD进行二级裂解,碰撞电压为30%,二级分辨率为17500。

9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述7‑甲基鸟苷、5‑(2‑羟乙基)‑4‑甲基噻唑、11,12‑二羟基‑5Z,8Z,14Z二十碳三烯酸、9S‑羟基‑10E,12Z,15Z‑十八碳三烯酸、前列腺素B1、L‑丙氨酰‑γ‑D‑谷氨酰‑L‑赖氨酸、壳二糖和4‑羟基他莫昔芬采用正离子模式检测,所述肌苷采用负离子模式检测。