1.桂花OfWRKY139基因在增强桂花香气物质合成中的应用，所述桂花OfWRKY139基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的桂花香气物质为(S)‑氧化芳樟醇、E‑氧化芳樟醇、茶螺烷、2,6,10,‑三甲基十三烷；

具体包括以下步骤：

1)采用TIANGEN植物RNA提取试剂盒提取日香桂盛花期花朵总RNA；采用TaKaRaPrimeScriptTMRTMasterMix反转录试剂盒将所提取到的RNA反转录成cDNA，最后得到的cDNA加水稀释10倍后于‑20℃冰箱保存；

2)获取目的基因片段

根据桂花全基因组数据库，筛选得到1个基因序列，与模式植物拟南芥的序列进行比对，判断该基因属于WRKY基因家族，根据该基因家族成员在染色体上的位置命名为OfWRKY139；利用BioXM软件对该基因的核苷酸全长序列进行酶切位点分析，选择XbaI和BamHI作为限制性内切酶酶切位点；利用CE design软件设计引物。按要求进行相关信息的填写，具体包括载体上的酶切位点附近的序列、目的基因全长、按照5’端和3’端的顺序填写酶切位点，即可得到扩增引物；设计好的序列由捷瑞生物公司合成；引物序列如下：pBI121‑OfWRKY139‑F：

5’‑GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGATGGCCTTTGGTAACATGAA‑3’，pBI121‑OfWRKY139‑R：

5’‑GGACTGACCACCCGGGGATCCAAATACGCACCTCTTCTTGCAAT‑3'；

以稀释10倍的日香桂OfWRKY139cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为：正向引物pBI121‑OfWRKY139‑F 1μL；反向引物pBI121‑OfWRKY139‑R1μL；cDNA 1μL；

Prime STAR 10μL；ddH2O 7μL；

PCR反应程序为：98℃变性10s；58℃退火15s；72℃延伸2min，35个循环；72℃总延伸

10min；16℃终止反应；

将扩增产物进行琼脂糖电泳检测，获得目的基因片段；

3)提前将切pBI121载体从‑80℃超低温冰箱中取出进行活化和摇菌，按照质粒提取试剂盒提取pBI121载体质粒，随后进行双酶切实验；

反应体系为：限制性内切酶BamHI 1μL；限制性内切酶XbaI 1μL；Buffer2μL；载体质粒XμL；ddH2O补足至20μL；其中XμL＝1000ng/载体质粒浓度ng/μL；

将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养1h；将双酶切后的载体进行琼脂糖电泳，然后利用试剂盒进行切胶回收；

连接体系如下：目的基因回收产物XμL；pBI121载体双酶切回收产物YμL；连接酶2μL；

Buffer 1μL；ddH2O补足至20μL；其中XμL＝200ng/目的基因回收产物浓度ng/μL，YμL＝

200ng/质粒双酶切回收产物浓度ng/μL；将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养30min，冰上2min；

转化：超净工作台内，用移液枪取5μL的连接产物于50μL的TreliefTM5α感受态细胞，轻弹混匀，冰浴5min，42℃水浴60s，再冰浴2min，加250μL液体LB，37℃，200rppm的摇床内孵育

30min；

涂板：取200μL孵育后的菌液，用灭菌的玻璃棒均匀涂布在LB固体培养基上，内含50mg/L的Kana并晾干，用封口膜后倒置在37℃恒温培养箱内培养12‑14h；

4)重组质粒筛选

当培养基上长出菌后，于超净工作台内进行单菌落检测。每个基因挑取8个饱满的单菌落，依序依次在含Kana抗性的LB固体培养基上进行备份，并用无菌牙签将相应的单菌落沾取至以下20μL体系中进行菌检：pBI121‑OfWRKY139‑F 1μL，pBI121‑OfWRKY139‑R 1μL，Green Mix 10μL，ddH2O 8μL；

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应。将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳，挑取3个长度正确的阳性单菌落送测，测得OfWRKY139基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，片段长度为

714bp，编码237个氨基酸的蛋白质，该蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；选取碱基错配率最低的且测序有重复的阳性单菌落提取质粒进行后续实验；

5)重组质粒转化农杆菌

将保存在‑80℃超低温冰箱内的GV3101感受态取出放在冰上融化；每33μL感受态加入1μL质粒，吸打混匀后依次冰浴20min、液氮速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min；加500μL无抗性的LB液体培养基，28℃，200rppm摇床上培养1h；培养完成后，将菌液6000r，离心1min，弃去部分上清液，留100μL均匀涂布于LB固体培养基上，内含50mg/L Kana，封口膜密封，倒置于28℃培养箱中培养40‑48h；将备份的板子中相对应的菌落挑入LB液体培养基中摇菌，再将菌液和50％甘油按3:7的体积比保菌，液氮中速冻后保存在‑80℃超低温冰箱内；

6)农杆菌介导转化‘波叶金桂’桂花花瓣

摇菌：将pBI121空载、P19辅助表达载体和已转入农杆菌的GUS::pBI121‑OfWRKY139目标基因融合表达载体的菌液于‑80℃取出常温融化至冰水混合状态后插入冰中融化，按照‑1

300μL菌液加入30mL LB液体培养基中含Kana 10μg·mL ，28℃、200rpm避光振荡培养，直至菌液OD600＝0.6‑0.8之间；

准备混合菌液：称取0.0196g的乙酰丁香酮粉末，使用二甲基亚砜助溶，再加入适量无‑1菌水定容到100mL，获得母液，取母液15mL加入85mL的无菌水，从而获得150μmol·L 的AS；

‑1

称取0.2035g的MgCl2和0.2135g的2‑(N‑吗啉)乙磺酸一水物加入到配好的150μmol·L 的AS溶液中；将菌液时进行离心，弃上清，收集菌体，使用当天配制的缓冲液进行重悬，最后按照最佳比例混合，P19辅助载体V：目的基因V＝5:7，充分震荡混匀后活化3h；

侵染：选取生长状态良好的桂花花瓣，使用真空泵将混合菌液注入桂花花瓣；

培养：将注射过目的基因混合菌液的瞬时转化植物，避光培养48h；

最终得到(S)‑氧化芳樟醇、E‑氧化芳樟醇、茶螺烷、2,6,10,‑三甲基十三烷的含量显著增多的转基因桂花。

2.桂花OfWRKY139基因在增强大花烟草香气物质合成中的应用，所述桂花OfWRKY139基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的大花烟草香气物质为γ‑焦烯、西柏烯和2,6‑二甲基‑2‑辛烯；

具体包括以下步骤：

1)侵染菌液的制备

提前一天晚上将pCAMBIA2300::OfWRKYs融合表达载体的菌液从超低温冰箱取出；取

200μL加入到20mL含Kana的LB培养液中，于28℃摇箱中200rpm避光振荡培养约12‑16h，摇至菌液的浓度为OD600＝0.4‑0.5；

2)外植体消毒

外植体选择未开花且无病虫害的健壮烟草叶片，首先将叶片清洗干净，依次进行流水冲洗20min、75％乙醇消毒30s，ddH2O清洗2‑3次、0.1％升汞消毒8‑10min，ddH2 O清洗3‑5次；用锋利刀片切掉叶片边缘和主脉，切成1cm×1cm大小方块；

3)农杆菌的转化

将切好的叶片放入准备好的菌液侵染10min左右，期间每隔2min轻轻地摇晃菌液；

4)烟草的遗传转化

共培养：将侵染过后的叶盘置于无菌滤纸上，吸去多余的菌液，于共生培养基上暗培

3d；筛选培养：将共培后的材料转接到选择培养基上，25℃光照培养，每两周更换一次培养基；壮芽培养：当叶盘周围的愈伤组织分化出抗性芽后，转接到壮芽培养基上生长，每两周更换一次培养基；生根培养：当不定芽约2cm时，轻轻的切下，转接到生根培养基；炼苗与移栽：根系发达时取出幼苗，清洗掉根部的培养基，于室内放置2d，后移栽到温室培养；

最终得到γ‑焦烯、西柏烯和2,6‑二甲基‑2‑辛烯的含量显著增多的转基因大花烟草。