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专利号: 2022115314241
申请人: 重庆医科大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-01
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于CYFRA21‑1检测的电致化学发光免疫传感器,其特征在于,用于CYFRA21‑1检测的电致化学发光免疫传感器的构建方法为:将用食人鱼洗液浸泡后经Al2O3粉末抛光呈镜面的玻碳电极在0.5 M H2SO4中进行电化学活化,然后用超纯水冲洗,干燥得到干燥的玻碳电极;将干燥的玻碳电极浸入1%HAuCl4溶液沉积30‑35 S,室温干燥后滴加抗体Ab1溶液,4‑5℃孵育10‑12 h,然后滴加1% 牛血清蛋白BSA溶液,4‑5℃孵育0.5‑1 h,再滴加目标物CYFRA21‑1溶液,4‑5℃孵育1‑1.5 h,最后滴加信号探针CS@La‑TCPP/AuNPs/Ab2溶液,4‑5℃孵育1.5‑2 h,即得到用于CYFRA21‑1检测的电致化学发光免疫传感器;所述CYFRA21‑1为细胞角蛋白片段抗原21‑1;

所述信号探针CS@La‑TCPP/AuNPs/Ab2溶液的制备步骤为:向CS@LaTCPP/AuNPs分散液中加入抗体Ab2溶液,冰浴搅拌10‑12 h,离心和沉淀物水洗,将沉淀物重新分散于超纯水中,即得到CS@La‑TCPP/AuNPs/Ab2的信号探针溶液;

所述CS@LaTCPP/AuNPs分散液的制备步骤为:将AuNPs加入到CS@La‑TCPP分散液中,在常温下搅拌7‑8 h,离心和沉淀物洗涤,再将沉淀物分散在超纯水中,即得到CS@La‑TCPP/AuNPs分散液;

所述CS@La‑TCPP分散液的制备步骤为:壳聚糖CS溶于0.1 wt%冰醋酸溶液中,分散均匀,取 La‑TCPP分散在超纯水中,加入CS溶液,磁力搅拌10‑12 h得到分散均匀的CS@La‑TCPP溶液;离心和沉淀物用超纯水洗涤后,再将沉淀物分散于超纯水中,得到CS@La‑TCPP分散液;

所述La‑TCPP的制备步骤为:将La(NO3)3· 6H2O、TCPP分别溶于N,N‑二甲基甲酰胺溶液中,分别室温超声10‑12 min,然后,在硅油浴中将TCPP溶液加热到100‑130℃,再加入La(NO3)3· 6H2O溶液,在连续磁力搅拌下,将混合物在100‑130℃条件下反应5‑6 h,冷却至室温后离心和沉淀用纯水洗涤三次,烘箱50‑60℃干燥,得到黑色的La‑TCPP。

2.如权利要求1所述的电致化学发光免疫传感器,其特征在于,所述AuNPs纳米粒子的制备步骤为:将1%HAuCl4溶液加入至超纯水中煮沸,然后加入1%柠檬酸三钠溶液继续煮沸15 min,冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为AuNPs纳米粒子。

3.一种用于CYFRA21‑1检测的电致化学发光免疫传感器,其特征在于,采用如下步骤:

(1)信号探针的制备;

1)La‑TCPP:将16.42 mgLa(NO3)3· 6H2O、30mg TCPP分别溶于4 mL和1ml N,N‑二甲基甲酰胺溶液中,室温超声10 min,然后,在硅油浴中将TCPP溶液加热到120℃,再加入La(NO3)3· 6H2O溶液,在连续磁力搅拌下,将混合物在该温度下保持反应6h,冷却至室温,离心和纯水洗涤三次后,烘箱60℃干燥,得到黑色的La‑TCPP材料;

2)CS@La‑TCPP分散液:称取10 mg的壳聚糖CS溶于10 mL 0.1 wt%的冰醋酸溶液中,分散均匀, 称取 1mg步骤1)制得的La‑TCPP分散在1ml超纯水中,加入1ml的CS溶液中,磁力搅拌12 h得到分散均匀的CS@La‑TCPP溶液;离心和超纯水洗涤后,再将沉淀物沉淀分散于1 mL 超纯水中,得到CS@La‑TCPP分散液;

3)AuNPs纳米粒子:将1 mL 1%HAuCl4溶液加入至100 mL超纯水中煮沸,然后迅速加入

2.5 mL 1%柠檬酸三钠溶液继续煮沸15 min,冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为AuNPs纳米粒子,于4℃保存;

4)CS@La‑TCPP/AuNPs:取450 μL 步骤3)制得的AuNPs加入步骤2)制得的CS@La‑TCPP分散液中,在常温下搅拌7 h,离心和洗涤,再将沉淀物分散在1 mL超纯水中,即得到CS@La‑TCPP/AuNPs分散液;

5)CS@La‑TCPP/AuNPs/Ab2:向1mL步骤4)制得的CS@LaTCPP/AuNPs分散液中加入100μL浓度为10 μg/mL的Ab2溶液,冰浴搅拌12 h,离心和水洗,将沉淀物重新分散于1 mL超纯水中,即得到CS@La‑TCPP/AuNPs/Ab2的信号探针溶液,并在4 ºC下储存备用;

(2)用于CYFRA21‑1检测的电致化学发光免疫传感器的构建:

1)用0.1 mM pH=7.4的PBS缓冲液室温下处理抗原CYFRA21‑1、抗体Ab1和抗体Ab2,4℃储存备用;

2)将玻碳电极用食人鱼洗液浸泡30 min后用超纯水冲洗干净备用;

3)将步骤2)得到的电极分别用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末抛光呈镜面,然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极,干燥备用;

4)将步骤3)得到的电极在0.5 M H2SO4中进行电化学活化,然后用超纯水冲洗,干燥;

5)将经步骤4)清洁的玻碳电极浸入1 mL 1%HAuCl4溶液沉积30S,室温干燥;

6)将10 μL Ab1溶液滴加在步骤5)制备得到的电极上4℃孵育12 h;

7)将10 μL 1% 牛血清蛋白BSA溶液滴加到步骤6)得到的电极上4℃孵育0.5 h;

8)将10 μL目标物CYFRA21‑1溶液滴加到步骤7)得到的电极上4℃孵育1.5 h;所述CYFRA21‑1为细胞角蛋白片段抗原21‑1;

9)将10 μL步骤(1)制备的CS@La‑TCPP/AuNPs/Ab2信号探针溶液滴加到步骤8)制备得到的电极上孵育4℃ 2 h,即得到用于CYFRA21‑1检测的电致化学发光免疫传感器。

4.利用权利要求1‑3任一项所述电致化学发光免疫传感器检测CYFRA21‑1的方法,其特征在于,包括如下步骤:

1)向权利要求1‑3任一项所述用于CYFRA21‑1检测的电致化学发光免疫传感器的电极上滴加不同浓度的目标物CYFRA21‑1溶液;

2)将电极置于含有5 mM K2S2O8的0.1 M pH=7.0的PBS溶液中进行表征,测量其发光强度值;

3)根据步骤2)所得发光强度与CYFRA21‑1浓度对数值的线性关系,绘制工作曲线;

4)将待测样品用权利要求1‑3任一项所述用于CYFRA21‑1检测的电致化学发光免疫传感器检测,将得到的电流值通过步骤3)制得的工作曲线计算得到待测样品的CYFRA21‑1浓度。