1.一种基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系,其特征在于,包括辅助载体以及重组载体;所述辅助载体为烟草脆裂病毒PTRV1,重组载体为含目的基因片段的烟草脆裂病毒PTRV2;所述目的基因片段来源于石菖蒲根状茎,为DIR基因特异性片段,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:S1、提取石菖蒲根状茎总RNA,反转录为石菖蒲根状茎cDNA;
S2、利用特异性引物进行石菖蒲cDNA片段PCR扩增,纯化获得目的基因片段;
S3、将步骤S2中的目的基因片段与烟草脆裂病毒PTRV2进行重组连接,获得含目的基因的重组载体;
S4、将步骤S3中的重组载体以及烟草脆裂病毒PTRV1分别转化到农杆菌GV3101感受态细胞,PCR鉴定阳性,分别获得含重组载体的菌液、含辅助载体的菌液;
S5、将步骤S4中的含重组载体的菌液、含辅助载体的菌液按体积比1:1混匀获得侵染液;将所述侵染液注射到石菖蒲根状茎,实现对特定目标基因的沉默。
3.根据权利要求2所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法,其特征在于,所述步骤S2中,当目的基因片段为石菖蒲根状茎的用于沉默DIR基因特异性片段时,对应的所述特异性引物为引物1和引物2;所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示,引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求2所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法,其特征在于,所述步骤S4中,筛选得到阳性菌株后,将其制成菌液接种至含抗生素的LB平板培养基上;待长出单克隆菌斑,挑取单克隆菌斑置于含抗生素的LB液体培养基中培养,得到单克隆菌液;然后将所述单克隆菌液以1:20的体积比转入液体诱导LB培养基中进行诱导培养,最终获得含重组载体的菌液/含辅助载体的菌液。
5.根据权利要求4所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法,其特征在于,所述含抗生素的LB平板培养基和所述含有抗生素的LB液体培养基中所含的抗生素为:50mg/ml卡那霉素、50mg/ml利福平。
6.根据权利要求2所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法,其特征在于,所述步骤S5中,侵染液的组成为:以无菌水为母液,并加入200umol/L的乙酰丁香酮,
10mmol/L的氯化镁,10mmol/L的MES,pH调至5.7,菌液OD600值调至1.0~1.2,现用现配。
7.根据权利要求2所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法,其特征在于,所述步骤S5中,侵染液侵染石菖蒲根状茎具体操作如下:将所述侵染液注入石菖蒲根状茎,根状茎材料为移出组培瓶两周后生根的组培苗,注射后暗处理12~24h,之后进行光周期养护。
8.根据权利要求7所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法,其特征在于,所述的光周期养护的培养条件:光照时间16~18h/d,温度为24~27℃,光照强度为2
25umol/(m·s),空气相对湿度为75%。