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专利号: 2022112758537
申请人: 湖南工程学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-11-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于DNA walker及支链杂交链式反应检测乳腺癌循环肿瘤核酸的探针组,其特征在于,包括熵驱动复合链S、NH探针、N1探针、N2探针、N3探针和辅助链F探针,所述熵驱动复合链S由C1探针、C2探针和C3探针杂交形成,所述熵驱动复合链S与所述NH探针结合于微球表面形成功能化微球,所述C1探针为DNA walker,所述C1探针含有8‑17脱氧核酶催化活

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性中心,所述探针组在Zn 催化下通过多重信号放大实现对乳腺癌靶标基因PIK3CA的高灵敏检测;

其中,所述C1探针的基因序列如SEQ ID NO.1所示,所述C2探针的基因序列如SEQ ID NO.2所示,所述C3探针的基因序列如SEQ ID NO.3所示,所述辅助链F探针的基因序列如SEQ ID NO.4所示,所述N1探针的基因序列如SEQ ID NO.5所示,所述N2探针的基因序列如SEQ ID NO.6所示,所述N3探针的基因序列如SEQ ID NO.7所示,所述NH探针的基因序列如SEQ ID NO.8所示。

2.一种如权利要求1所述探针组用于非诊疗目的检测乳腺癌循环肿瘤核酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、探针序列预处理:将C1探针、C2探针、C3探针、NH探针、N1探针、N2探针、N3探针和辅助链F探针分别溶解于缓冲液中,将C1探针、C2探针、C3探针溶液混合孵育得到熵驱动复合链S;分别将NH探针、N1探针、N2探针、N3探针分别进行孵育形成亚稳态的发夹结构;

S2、构建功能化微球:将微球与步骤S1中的熵驱动复合链S和发夹结构的NH探针溶液混合孵育,得到功能化微球;

S3、熵驱动复合链S置换反应及DNA walker切割反应:向待检测溶液中加入功能化微球、辅助链F探针溶液和ZnCl2溶液反应得到第一反应液;

S4、支链杂交链式反应形成G‑四链体:将步骤S3中的第一反应液离心取上清液,加入N1探针、N2探针和N3探针溶液反应得到第二反应液;

S5、G–四链体–血红素DNA酶的形成和比色分析:将步骤S4的第二反应液于黑暗条件下加入氯化血红素,避光反应30~60 min形成G–四链体–血红素 DNA 酶;再加入 H2O2和ABTS,充分搅拌反应后得到第三反应液,将第三反应液进行紫外分光光度计检测,根据A420nm处的最大吸收峰,根据标准曲线测算得到待检测物中是否含有乳腺癌靶标基因PIK3CA及其浓度,所述乳腺癌靶标基因PIK3CA的基因序列如SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中C1探针、C2探针、C3探针溶液混合,在95 ℃孵育5 min ,然后以降温速率为0.1 ℃/s缓慢降至室温,且于室温下孵育0.5 h形成熵驱动复合链S。

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中NH探针、N1探针、N2探针、N3探针溶液分别在95 ℃孵育5 min ,然后以降温速率为0.1 ℃/s缓慢降至室温,且于室温下孵育0.5 h形成亚稳态的发夹结构。

5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S2中孵育温度为室温,孵育时间为30 60 min,孵育过程中间隔5 min混匀。

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6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S3中反应温度为37 ℃,反应时间为1 2 h。

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7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S4中反应温度为25 ℃,反应时间为2 3 h。

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8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述A420nm处的最大吸收峰值为ΔA420nm=A420nm-A0,其中A420nm为样品的测量值,A0为乳腺癌靶标PIK3CA基因浓度为0时的背景值。