1.一种提高乳酸发酵液过滤效率的方法,其特征在于,通过敲除乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的肽链内切酶基因,使乳酸片球菌的细胞壁裂解酶的酶系不全,降低菌体裂解效率,从而使菌体个体变大,同时不易造成菌体内含物的释放,简化发酵液后道提取工艺中的菌体去除工序;
所述乳酸片球菌具体为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)DSM 20284或乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) ATCC 8042;
所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)DSM 20284敲除肽链内切酶基因位点HMPREF0623_RS03040;
所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ATCC 8042敲除肽链内切酶基因位点EEA44_RS00235。
2.根据权利要求1所述的一种提高乳酸发酵液过滤效率的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)提取乳酸片球菌肽链内切酶基因的上下游基因片段:使用MRS培养基培养菌株,提取菌体基因放置‑20℃冰箱保存备用;根据乳酸片球菌菌株肽链内切酶基因序列设计上下游基因序列引物,通过pcr的方法获取上下游基因片段,放置‑20℃冰箱保存备用;
(2)将肽链内切酶基因上下游基因片段装进pSET4e温敏型敲除质粒:把乳酸片球菌的肽链内切酶基因上下游基因片段通过无缝克隆的方式连接进pSET4e敲除质粒,形成新的敲除质粒pSET4e‑endop;
(3)将敲除质粒pSET4e‑endop转化进乳酸片球菌:
制备乳酸片球菌感受态细胞后,将敲除质粒pSET4e‑endop电转化进乳酸片球菌感受态细胞;将转化后的感受态细胞稀释不同倍数,涂布于带质粒抗生素抗性的MRS培养皿,30℃培养3天至菌落出现,选用菌落数量在10 50的培养皿进行阳性克隆验证,选择含有敲除质~粒pSET4e‑endop的乳酸片球菌备用;
(4)将含有敲除质粒pSET4e‑endop的乳酸片球菌进行单交换,使敲入质粒进入乳酸片球菌基因组:将含有敲除质粒pSET4e‑endop的乳酸片球菌接入带质粒抗生素抗性的MRS液体试管,
30℃培养至OD660为0.6,稀释不同倍数后涂布于带质粒抗生素抗性的MRS平板,42℃静置培养24 48小时至菌落出现,挑取菌落进行pcr验证,选择通过验证的单交换的乳酸片球菌备~用;
(5)将单交换的乳酸片球菌进行双交换,使肽链内切酶基因从基因组中脱离,获得敲除肽链内切酶基因的乳酸片球菌:将单交换的乳酸片球菌接入含带质粒抗生素抗性的MRS液体试管,42℃培养至OD660为
0.6,稀释不同倍数后涂布于MRS平板,42℃静置培养24 48小时至菌落出现;将同一个菌落~分别挑至带质粒抗生素抗性的MRS平板和不含抗生素的MRS平板,标上序号,以便分清菌落;
再将平板42℃静置培养24 48小时,待菌落出现进行比对;当同一序号的菌在含抗生素MRS~平板上没生长而在不含抗生素MRS平板生长的,就视为潜在的双交换菌,再进行pcr验证,确认为双交换菌后进行甘油冻存管保存;此步保存的菌为敲除肽链内切酶基因的乳酸片球菌;
(6)用敲除肽链内切酶基因的乳酸片球菌发酵,测试发酵液菌体去除工序简化效果:使用敲除肽链内切酶基因的乳酸片球菌在MRS液体培养基发酵乳酸;发酵结束后将发酵液静置10分钟,菌体絮凝沉降后经过板框压滤机过滤去除菌体,进入后道提取工序。
3.根据权利要求2所述的一种提高乳酸发酵液过滤效率的方法,其特征在于,步骤(1)所述MRS培养基培养菌株的条件为42℃螺口试管静置培养至OD660为1.0。
4.根据权利要求2所述的一种提高乳酸发酵液过滤效率的方法,其特征在于,步骤(3)所述电转化条件为:使用1mm电转杯,25kV/cm,200Ω,电转时间在 4 6 ms;
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所述稀释不同倍数为10到10000倍。
5.根据权利要求2所述的一种提高乳酸发酵液过滤效率的方法,其特征在于,步骤(6)所述MRS液体培养基额外添加5%的葡萄糖和3%的碳酸钙。