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专利号: 2022107126768
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-30
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种高产吩嗪‑1‑羧酸的绿针假单胞菌基因工程菌,其特征在于,具体是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu‑1基因组中的phzO基因、degU基因、tctB基因和hppA基因,得到绿针假单胞菌基因工程菌QPCAΔDTH,其中绿针假单胞菌Qlu‑1已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国,武汉,武汉大学,保藏日期为2020年05月08日,保藏编号为CCTCC NO:M2020108;

phzO基因的序列如SEQ ID NO.1所示;

degU基因的序列如SEQ ID NO.7所示;

tctB基因的序列如SEQ ID NO.13所示;

hppA基因的序列如SEQ ID NO.19所示。

2. 一种如权利要求1所述的高产吩嗪‑1‑羧酸的绿针假单胞菌基因工程菌的构建方法,其特征在于,以具有吩嗪1‑羧酸合成能力的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu‑1为出发菌株,首先敲除修饰基因phzO获得菌株QPCA,之后先后在菌株QPCA基因组上敲除具有负调控作用的degU、tctB、hppA基因,构建得到高产吩嗪‑1‑羧酸的绿针假单胞菌基因工程菌QPCAΔDTH。

3.如权利要求2所述的构建方法,其特征在于,phzO基因的敲除方法如下:i、扩增phzO基因片段的上下游同源臂;采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得phzO基因重组质粒;

ii、将phzO基因重组质粒导入大肠杆菌S17‑1(λ)后与绿针假单胞菌Qlu‑1进行双亲杂交培养,从而将phzO基因重组质粒导入绿针假单胞菌Qlu‑1;

iii、筛选阳性克隆,即得菌株QPCA。

4. 如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,phzO基因的序列如SEQ ID NO.1所示;

扩增phzO基因片段上游同源臂的引物包括phzO‑F1和phzO‑R1,序列分别如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示;

扩增phzO基因片段下游同源臂的引物包括phzO‑F2和phzO‑R2,序列分别如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示;

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的phzO基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.6所示。

5.如权利要求2所述的构建方法,其特征在于,degU基因的敲除方法如下:(1)利用试剂盒提取QPCA基因组;

(2)在已经测序的绿针假单胞菌Qlu‑1基因组序列中搜索degU基因及其上下游序列,并通过PCR钓取并连接degU基因的上下游片段degU‑ud;

(3)通过无缝克隆技术将degU‑ud片段连接质粒pk18moBsacB构建degU敲除质粒pK18‑degU‑ud;

(4)通过热击转化将pK18‑degU‑ud导入大肠杆菌S17‑1(λ);

(5)将菌株QPCA与大肠杆菌S17‑1(λ)共同培养后涂布于KB(A+K+)双抗平板后挑选单菌落;

(6)通过蔗糖平板筛选、影印筛选及PCR筛选共同筛选QPCA敲除degU菌株。

6. 如权利要求5所述的构建方法,其特征在于,degU基因的序列如SEQ ID NO.7所示;

扩增degU基因片段上游同源臂的引物包括degU‑F1和degU‑R1,序列分别如SEQ ID NO.8和SEQID NO.9所示;

扩增degU基因片段下游同源臂的引物包括degU‑F2和degU‑R2,序列分别如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示;

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的degU基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.12所示。

7. 如权利要求2所述的构建方法,其特征在于,tctB基因的敲除方法与degU基因的敲除方法相同,tctB基因的序列如SEQ ID NO.13所示;

扩增tctB基因片段上游同源臂的引物包括tctB‑F1和tctB‑R1,序列分别如SEQ ID NO.14和SEQID NO.15所示;

扩增tctB基因片段下游同源臂的引物包括tctB‑F2和tctB‑R2,序列分别如SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.17所示;

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的tctB基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.18所示。

8. 如权利要求2所述的构建方法,其特征在于,hppA基因的敲除方法与degU基因的敲除方法相同,hppA基因的序列如SEQ ID NO.19所示;

扩增hppA基因片段上游同源臂的引物包括hppA‑F1和hppA‑R1,序列分别如SEQ ID NO.20和SEQID NO.21所示;

扩增hppA基因片段下游同源臂的引物包括hppA‑F2和hppA‑R2,序列分别如SEQ IDNO.22和SEQ ID NO.23所示;

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的hppA基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.24所示。

9.一种如权利要求1所述的高产吩嗪‑1‑羧酸的绿针假单胞菌基因工程菌的应用,其特征在于,使用绿针假单胞菌基因工程菌QPCAΔDTH发酵生产吩嗪1‑羧酸。