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专利号: 202210481013X
申请人: 重庆医科大学国际体外诊断研究院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法,其特征在于,其包括:利用液滴微流控技术对n个待分析细胞进行单细胞捕获并包装,n为正整数且≥10,生成包含单个细胞和mRNA捕获探针的水凝胶微球,对所述水凝胶微球中的单细胞进行裂解和mRNA反转录,获得mRNA的反转录产物:全长cDNA;

将n个所述水凝胶微球分为x份,x为正整数且<n,对每一份水凝胶微球采用随机引物对将全长cDNA延伸为多个二链cDNA片段,形成全长cDNA与二链cDNA片段的杂交嵌合体,每一份水凝胶微球的随机引物上标记有不同的特异性标签,随后将x份水凝胶微球合并成一份;

在所有水凝胶微球的标签上进行k次标记新的特异性标签的步骤,以形成多级标签,当所述多级标签的种类≥n时,停止标记;

采用具有链取代活性的聚合酶将所有水凝胶微球中二链cDNA片段延伸并取代下来,对取代后获得的产物进行扩增,获得测序文库。

2.根据权利要求1所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法,其特征在于,所述随机引物的作用浓度为能够使延伸获得的二链cDNA片段的长度在二代测序的读长范围内;

优选地,二代测序的读长为300~500bp;

优选地,所述随机引物的作用浓度为0.2~30μM,随机引物的长度为6~10nt;

优选地,在采用所述随机引物对全长cDNA进行延伸时,所述构建方法还包括在延伸体系中添加dNTPs和ddNTPs;

优选地,dNTPs和ddNTPs的作用浓度为能够用于使二链cDNA片段的长度在二代测序的读长范围内;

优选地,所述dNTPs的作用浓度为0.05~0.5mM,所述ddNTPs的作用浓度为0.05~

0.5mM。

3.根据权利要求1或2所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法,其特征在于,每次进行所述标记新的特异性标签的步骤包括:将x份水凝胶微球混合后重新分成y份,y为正整数且<n,然后分别在每一份水凝胶微球中随机引物的标签上标记不同的特异标签以形成多级特异标签;

优选地,y份水凝胶微球的分配方式为平均分配;

优选地,y与x相等。

4.根据权利要求3所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法,其特征在于,在水凝胶微球中随机引物的标签上标记不同的特异标签以形成多级特异标签的步骤包括:在水凝胶微球中添加连接酶、含有标签序列的连接探针;

所述连接探针为核酸序列,包含3个相连的部分:第一序列、标签序列和第二序列,所述第一序列为用于与二链cDNA片段上的已有的连接探针相互杂交的序列,所述第二序列为用于与后续的连接探针相互杂交的序列;

优选地,所述在水凝胶微球中随机引物的标签上标记不同的特异标签以形成多级特异标签的步骤还包括在水凝胶微球中添加连接子,所述第一序列通过所述连接子与二链cDNA片段上的已有的连接探针相互杂交,所述第二序列通过所述连接子与后续连接探针上的第一序列相互杂交;

优选地,所述标记新的特异性标签的反应条件如下:所述连接酶的作用浓度为1~

5unit/μL;所述连接探针的作用浓度为0.5~15μM,反应时间为0.5~2.5h。

5.根据权利要求4所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法,其特征在于,进行第k次标记新的特异性标签时,所述连接探针上还包括有分子标签UMIs。

6.根据权利要求1或2所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法,其特征在7

于,n为10~10。

7.一种高通量单细胞全长转录组的测序方法,其特征在于,其包括:采用如权利要求1~6任一项所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法构建高通量单细胞全长转录组测序文库,并对所述测序文库进行测序。

8.根据权利要求7所述的高通量单细胞全长转录组的测序方法,其特征在于,所述测序包括对测序数据的拼接,所述拼接的步骤如下:在获得的所述测序文库中,每一条全长转录组扩增的相连两条二链cDNA片段之间具有一部分的重叠序列,利用所述重叠序列将Reads进行拼接,以获得测序分析结果;

优选地,所述测序为二代测序。

9.组合物在制备用于高通量单细胞全长转录组测序的试剂盒中的应用,其特征在于,所述组合物包括:用于实施如权利要求1~6任一项所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法或如权利要求7或8所述的高通量单细胞全长转录组的测序方法的试剂。

10.一种高通量单细胞全长转录组测序的试剂盒,其特征在于,其包括:用于实施如权利要求1~5任一项所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法或如权利要求7或

8所述的高通量单细胞全长转录组的测序方法的试剂。