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专利号: 2022104154713
申请人: 湖南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种提高博落回中血根碱含量的方法,其特征在于,通过沉默博落回中的McSMT基因表达或者敲除McSMT基因,提高博落回中血根碱含量,所述的McSMT基因全长序列及CDS区序列如SEQ ID NO.1和2所示;

采用CRISPR/Cas9 基因编辑体系敲除McSMT基因;

具体包括以下步骤:

1)博落回McSMT基因靶位点引物设计与合成;

2)博落回基因敲除载体构建;

3)根癌农杆菌介导的博落回遗传转化;

步骤1)博落回McSMT基因靶位点引物设计与合成:①、使用植物基因组编辑靶位点设计软件,在博落回McSMT基因的编码区避开内含子区域设计一个McSMT基因靶位点Guide1,所述Guide1序列为GCCGCGGATGTGTGGGTACT;

②、以①中设计的基因靶位点Guide1,结合pRGEB32质粒Bsa I酶切粘性末端设计靶位点引物对pRGEB32‑SMT‑Guide 1‑Oligo 1和pRGEB32‑SMT‑Guide 1‑Oligo 2,具体序列:pRGEB32‑SMT‑Guide 1‑Oligo 1:GGCAGCCGCGGATGTGTGGGTACT;

pRGEB32‑SMT‑Guide 1‑Oligo 2:AAACAGTACCCACACATCCGCGGC;

步骤2)博落回基因敲除载体构建:

①、将pRGEB32质粒用Bsa I酶切成线性化质粒,电泳,回收纯化目标片段;

②、将合成的靶位点Oligos序列进行退火磷酸化反应,获得靶点双链;

③、将②中的靶点双链序列通过连接酶与pRGEB32线性化载体相连接,连接产物转染至DH5α感受态细胞细胞中,震荡培养,抗生素筛选,菌落PCR鉴定筛选阳性克隆,鉴定正确重组载体命名为:pRGEB32‑SMT1。

2.根据权利要求1所述的提高博落回中血根碱含量的方法,其特征在于,步骤3)根癌农杆菌介导的博落回遗传转化:①、将已构建好的重组质粒pRGEB32‑SMT1转化根癌农杆菌,震荡培养,抗生素筛选,得到根癌农杆菌单菌落;

②、挑选根癌农杆菌单克隆提取质粒,PCR鉴定筛选阳性克隆测序,阳性克隆进行扩大培养,菌液进行博落回外植体侵染;

③、完成侵染的博落回外植体进行共培养,后进行筛选培养,完成整个组培过程,获得博落回转基因阳性幼苗。

3.根据权利要求1所述的提高博落回中血根碱含量的方法,其特征在于,载体构建鉴定引物M13R: GAGCGGATAACAATTTCACACAGGpRGEB32‑R:GACCCGAATTTGTGGACCTG。

4.根据权利要求1所述的提高博落回中血根碱含量的方法,其特征在于,McSMT基因靶位点突变鉴定引物:SMT‑F:ATGGATGCCAAATTAGAAGAAGCGA;

SMT‑R:TGAAACTCAATGACATGGAGACCTT。

5.根据权利要求4所述的提高博落回中血根碱含量的方法,其特征在于,基因编辑结果鉴定:农杆菌介导的pRGEB32‑SMT1质粒遗传转化获得再生植株提取总DNA,使用引物对SMT‑F/SMT‑R扩增包含基因靶位点的目的片段,测序鉴定靶位点碱基突变。

6.权利要求1‑5任一项所述方法在培育提高血根碱含量的博落回新种质中的应用。