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专利号: 2022100208945
申请人: 重庆医科大学国际体外诊断研究院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-12
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种快速检测循环肿瘤DNA基因突变的方法,其特征在于,包括如下步骤:采用三维DNA步行器识别和结合靶DNA,在核酸内切酶驱动下循环剪切轨道链S,产生的输出链OD与crRNA特异性结合,并激活Cas12a的非特异性反式裂解活性,从而切割信号报告分子,产生荧光信号,以检测循环肿瘤DNA基因突变。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述循环肿瘤DNA基因突变为循环肿瘤DNA BRAF V600E基因突变,即所述靶DNA,所述靶DNA序列如SEQ ID NO.3所示;

所述三维DNA步行器包括包括步行链DW、轨道链S,以核酸内切酶为驱动力,所述步行链DW序列如SEQ ID NO.1所示,所述轨道链S序列如SEQ ID NO.2所示;

所述核酸内切酶为限制性核酸内切酶Nb.BbvCI;

所述crRNA序列如SEQ ID NO.4所示;

所述信号报告分子序列如SEQ ID NO.5所示,所述信号报告分子的5’端修饰有荧光基团,3’端修饰有淬灭基团。

3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1)将生物素修饰的步行链DW变性后形成发夹结构,然后将生物素修饰的轨道链S和发夹状DW加入到含链霉亲和素磁珠的结合缓冲液中,孵育形成DW‑S‑MBs混合液;接着用TE缓冲液通过磁分离洗涤磁珠,并用TE缓冲液重悬后形成纯化的DW‑S‑MBs溶液;

(2)将DW‑S‑MBs纯化溶液、靶DNA、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶缓冲液混合反应,以触发三维DNA步行器扩增反应;

(3)使用磁分离后的上清液触发CRISPR/Cas12a荧光反应系统,并灭活Cas12a蛋白;

(4)最后通过测量荧光信号强度获得靶DNA的浓度。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)中,将生物素修饰的步行链DW在95℃水浴条件下变性,形成发夹结构;

和/或,所述步骤(1)中,轨道链S和发夹状DW的摩尔比为(5~40):1;

和/或,所述步骤(1)中,将生物素修饰的轨道链S和发夹状DW加入到含链霉亲和素磁珠的结合缓冲液中,在金属浴中振荡孵育形成DW‑S‑MBs混合液;

和/或,所述步骤(1)中,孵育温度为37℃,孵育时间为30~60分钟。

和/或,所述步骤(1)中,所述结合缓冲液包含以下成分:20mM Tris、1M NaCl、1mM EDTA、pH 7.5,0.0005%TritonX·100;

‑1 ‑1

和/或,所述步骤(1)中,所述TE缓冲液包含以下成分:10mmol L  Tris·HCl,1mmol L  EDTA,pH 8.0;

和/或,所述步骤(1)中,所述含链霉亲和素磁珠的结合缓冲液制备方法包括如下步骤:将链霉亲和素磁珠原液用结合缓冲液洗涤,然后将洗涤过的磁珠悬浮在结合缓冲液中。

5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)中,限制性核酸内切酶的浓度为5~15U;

和/或,所述步骤(2)中,反应时间为20~60分钟。

6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述步骤(3)中,所述CRISPR/Cas12a荧光反应系统包含:Cas12a、CRISPR·crRNA、10×NEBuffer、信号报告分子Reporter和RNase抑制剂;

和/或,所述步骤(3)包括如下步骤:使用经过磁分离后的上清液触发CRISPR/Cas12a荧光反应系统,在37℃孵育25分钟,然后在95℃下终止反应5分钟,以灭活Cas12a;

和/或,所述步骤(4)中,使用荧光分光光度计测量荧光信号强度,测量参数为:激发波长525nm,发射波长范围为540nm至640nm,激发和发射的狭缝分别设置为5nm和10nm,检测电压为600V,556nm处的荧光强度用来量化靶DNA的浓度。

7.一种三维DNA步行器,其特征在于,包括步行链DW、轨道链S,以核酸内切酶为驱动力,所述步行链DW序列如SEQ ID NO.1所示,所述轨道链S序列如SEQ ID NO.2所示。

8.根据权利要求7所述的三维DNA步行器,其特征在于:所述核酸内切酶为限制性核酸内切酶Nb.BbvCI。

9.一种用于检测循环肿瘤DNA基因突变的系统,其特征在于:包括权利要求7~8任一项所述的三维DNA步行器,还包括CRISPR/Cas12a荧光反应系统,所述CRISPR/Cas12a荧光反应系统包含:Cas12a、CRISPR·crRNA、10×NEBuffer、信号报告分子Reporter和RNase抑制剂。

10.根据权利要求1~6任一项所述的方法、权利要求7~8任一项所述的三维DNA步行器、权利要求9所述的系统在制备用于检测循环肿瘤DNA基因突变的试剂中的应用。