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专利号: 2021116663565
申请人: 重庆大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种高毒力蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)工程菌,其特征在于:所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了编码主要变应原Asp f2类蛋白的MaAL基因的工程菌株;所述蝗绿僵菌采用保藏编号为CGMCCNo.0877的CQMa102菌株,所敲除的MaAL基因为蝗绿僵菌CQMa102菌株的基因,基因序列为SEQ ID NO.23所示。

2.如权利要求1所述的蝗绿僵菌工程菌,其特征在于:所敲除的MaAL基因被该基因的上游同源臂、标记基因以及其下游同源臂组成的重组基因所代替。

3.如权利要求1或2所述的蝗绿僵菌工程菌在制备杀蝗虫剂中的应用。

4.一种杀蝗虫菌剂,它的活性成分是高毒力的蝗绿僵菌工程菌,所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了编码主要变应原Asp f2类蛋白的MaAL基因的工程菌株;所述蝗绿僵菌采用保藏编号为CGMCCNo.0877的CQMa102菌株,所敲除的MaAL基因为蝗绿僵菌CQMa102菌株的基因,基因序列为SEQ ID NO.23所示。

5.如权利要求4所述的杀蝗虫菌剂,其特征在于:所述蝗绿僵菌工程菌中,所敲除的MaAL基因被该基因的上游同源臂、标记基因以及其下游同源臂组成的重组基因所代替。

6.如权利要求1或2所述高毒力蝗绿僵菌工程菌的构建方法,其特征在于,包括如下步骤进行:

1)PK2‑PB‑MaAL‑L/R重组质粒的构建

根据蝗绿僵菌基因组序列设计PCR引物,扩增出MaAL基因的上、下游同源臂,并纯化扩增产物,上游同源臂为左臂,基因序列为SEQ ID NO.21所示,下游同源臂为右臂,基因序列为SEQ ID NO.22所示,酶切载体质粒PK2‑PB并纯化线性质粒,上、下游同源臂片段与线性质粒在重组酶中进行一步克隆,重组产物至大肠杆菌感受态DH5α,得到PK2‑PB‑ MaAL‑L/R重组质粒;

2)回复载体PK2‑MaAL‑sur::egfp的构建

从蝗绿僵菌基因组中扩增带有MaAL基因自身启动子与编码区ORF序列,基因序列为SEQ ID NO.23所示,与PK2‑sur::egfp载体使用一步克隆的方法进行连接;

3)农杆菌的转化以及与蝗绿僵菌的共培养

将PK2‑PB‑MaAL‑L/R的质粒转化农杆菌后与野生蝗绿僵菌孢子共培养发生同源重组;

回复PK2‑MaAL‑sur::egfp质粒转化农杆菌后与ΔMaAL蝗绿僵菌孢子共培养;

4)蝗绿僵菌转化子的筛选

经PCR初步验证转化子及Southern blot验证得到蝗绿僵菌MaAL基因敲除突变株以及回复菌株。