1.一种调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK‑7的方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤一、以大肠杆菌BL21基因组为模板,经扩增、基因片段重叠延伸PCR、扩增产物纯化后转化到大肠杆菌基因BL21感受态细胞中,得到△ispB菌株EC1;
步骤二、以枯草芽孢杆菌168基因组为模板,PCR扩增得到hepT基因片段,将PCR产物连接载体pET‑28得到重组质粒pET‑hepT,之后转化至EC1中,得到菌株EC2;
步骤三、根据待突变LsrR的氨基酸位点来设计PCR点突变引物,以构建的重组质粒pET‑lsrR为模板,通过PCR扩增出产物,经转化处理得到突变的重组质粒转入EC2,得到菌株EC3;
步骤四、根据待突变lsrK的氨基酸位点来设计PCR点突变引物,以构建的重组质粒pET‑lsrK为模板,通过PCR扩增出产物,经转化处理得到突变的重组质粒转入EC3,得到用于高效合成MK‑7的菌株EC4。
2.根据权利要求1所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK‑7的方法,其特征在于,所述步骤一中扩增是采用如SEQ ID NO.1‑6所示的引物组PCR扩增得到左、右同源臂和中间片段。
3.根据权利要求2所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK‑7的方法,其特征在于,三个基因片段重叠延伸PCR的条件为:98℃预变性5min;然后98℃变性10s,55℃退火5s,72℃延伸32s,总共34个循环。
4.根据权利要求1所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK‑7的方法,其特征在于,所述步骤二中PCR扩增是采用如SEQ ID NO.7‑8所示的引物对进行扩增。
5.根据权利要求1所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK‑7的方法,其特征在于,所述重组质粒pET‑lsrR的构建方法包括如下步骤:A1、将大肠杆菌BL21培养至指数生长中期,提取全基因组DNA;
A2、设计如SEQ ID NO.9‑10所示的引物对以进行PCR扩增;
A3、扩增产物纯化后,用XbaI和BglII对PCR产物和载体pET‑28a进行双酶切,回收产物用T4连接酶连接得到重组质粒pET‑lsrR。
6.根据权利要求5所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK‑7的方法,其特征在于,所述待突变LsrR的氨基酸位点为LsrR的第123位天冬酰胺,设计PCR点突变引物对如SEQ ID NO.11‑12所示,以将第123位天冬酰胺突变为赖氨酸,扩增产物转化处理得到重组质粒pET‑N123K
lsrR’转入菌株EC2,得到待表达的突变株EC2 ,即菌株EC3。
7.根据权利要求6所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK‑7的方法,其特征在于,所述重组质粒pET‑lsrK的构建方法包括如下步骤:A1、将大肠杆菌BL21培养至指数生长中期,提取全基因组DNA;
A2、设计如SEQ ID NO.13‑14所示的引物对以进行PCR扩增;
A3、扩增产物纯化后,用XbaI和BglII对PCR产物和载体pET‑28a进行双酶切,回收产物用T4连接酶连接得到重组质粒pET‑lsrK。
8.根据权利要求7所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK‑7的方法,其特征在于,所述待突变LsrK的氨基酸位点为LsrK的第325位谷氨酰胺,设计PCR点突变引物对如SEQ ID NO.15‑16所示,以将第325位谷氨酰胺突变为组氨酸,扩增产物转化处理得到重组质粒pET‑Q325H
lsrK’转入菌株EC2,得到待表达的突变株EC3 ,即菌株EC4。
9.根据权利要求8所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK‑7的方法,其特征在于,所述PCR点突变的扩增体系为:质粒DNA 1uL,Buffer with MgSO45uL,引物各1uL,dNTP 1uL,DNA Polymerase 1.2uL,ddH2O补至50uL。
10.根据权利要求8所述调节大肠杆菌菌膜形态和高效合成MK‑7的方法,其特征在于,所述PCR点突变的扩增条件为:95℃预变性3min;依次以95℃变性30s,60℃退火60s,68℃延伸76s进行循环18次,最后68℃延伸10min。