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专利号: 2021114925417
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-10-09
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于检测碱性磷酸酶的单分子荧光生物传感器,其特征在于,所述单分子荧光生物传感器包括:单链DNA、发夹探针1(HP1)、发夹探针2(HP2)、链霉亲和素偶联磁珠、氢氧化钠溶液和λ exo酶;其中,单链DNA为在3'端标记生物素的5'磷酸化的单链DNA;发夹探针1(HP1)和发夹探针2(HP2)为Cy5标记的发夹探针;单链DNA和发夹探针1(HP1)和发夹探针2(HP2)通过链置换反应形成探针•HP1•HP2三重链;

所述单链DNA从5'端到3'端的序列为:P‑AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA TTT TTT‑Biotin;

发夹探针1(HP1)从5'端到3'端的序列为:TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG‑Cy5;

发夹探针2(HP2)从5'端到3'端的序列为:AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG‑Cy5。

2.根据权利要求1所述的单分子荧光生物传感器,其特征在于,所述氢氧化钠溶液浓度为1.5‑2mol/L。

3.根据权利要求2所述的单分子荧光生物传感器,其特征在于,所述氢氧化钠溶液浓度为1mol/L。

4.一种非诊断目的的利用权利要求1‑3任一项所述的单分子荧光生物传感器的碱性磷酸酶检测方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)将含碱性磷酸酶的待测物、在3'端标记生物素的5'磷酸化的单链DNA和缓冲液混合,在适当温度下进行孵育;(2)然后加入λ exo酶在适当温度下反应;(3)将反应得到的消化产物加入到含有杂交缓冲液、HP1和HP2的溶液中,在适当温度下反应;(4)随后加入链霉亲和素偶联磁珠捕获杂交产物,并通过磁分离去除未反应的HP1和HP2;(5)用反应缓冲液洗涤后,加入NaOH溶液孵育,诱导DNA链解体,得到含有游离HP1和HP2的上清液,用于进一步测定。

5.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中,在3'端标记生物素的5'磷酸化的单链DNA的浓度为200‑300纳摩尔每升;缓冲液为10×CutSmart缓冲液;在37℃下孵育30‑50分钟。

6.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶检测方法,其特征在于,步骤(2)中,λ exo酶的用量为3‑5 U;在37℃下反应20‑40分钟。

7.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶检测方法,其特征在于,步骤(3)中,杂交缓冲液由

50 毫摩尔每升Na2HPO4和 0.5摩尔每升NaCl组成,其pH为 6.8;HP1和HP2浓度为400纳摩尔每升;在37°C下反应0.5‑2小时。

8.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶检测方法,其特征在于,步骤(4)中,链霉亲和素包覆的磁珠的用量为4‑6微升。

9.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶检测方法,其特征在于,步骤(5)中,加入含1摩尔每升NaOH的蒸馏水50微升,反应5分钟,诱导DNA链解体。