1.一种海洋无脊椎动物血细胞悬液的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
1)抽取海洋无脊椎动物血液,添加改良抗凝剂,改良抗凝剂与血液按照(1‑3):1的体积比添加;所述的改良抗凝剂是每升去离子水中溶解EDTA 3.5‑4.5g、柠檬酸钠 7.5‑10.0g、葡萄糖20.0‑25.0g、NaCl 20.0‑25.0g,调节pH为7.0‑8.0,用0.22μm滤膜过滤除菌得到;所述的海洋无脊椎动物,选自海洋贝类和海洋节肢动物;
2)混匀后用40μm细胞筛过滤;过滤液于4℃,400g下离心5‑8min,回收细胞;
3)弃上清液,于沉淀中加入1mL预冷的平衡盐溶液,使用宽口枪头轻轻吹吸5‑10次,重悬细胞,并于4℃,400g下离心5‑8min,回收细胞;所述的平衡盐溶液,通过如下步骤制备得到:(1)每升去离子水中溶解10‑15mM KCl、400‑500mM NaCl、20‑23mM Na2HPO4、10‑13mM HEPES、青霉素500‑700U/ml、链霉素400‑600μg/ul、制霉菌素2‑4μg/ml;(2)调节上步骤得到的溶液pH为7.0‑7.5,用0.22μm滤膜过滤除菌,得到所述的平衡盐溶液;
4)弃上清液,于沉淀中加入5mL预冷的平衡盐溶液,使用宽口枪头轻轻吹吸5‑10次,重悬细胞;
5)用40μm细胞筛过滤,并用3mL预冷的平衡盐溶液冲洗一次,并于4℃,400g下离心5‑
8min,回收细胞;
6)弃上清液,于沉淀中加入100‑500μL预冷的平衡盐溶液,使用宽口枪头轻轻吹吸5‑10次,重悬细胞;
7)吸取10μL细胞悬液,用0.02‑0.04%台盼蓝溶液染色,于显微镜下用细胞计数板观察细胞浓度及活性。
2.根据权利要求1所述的一种海洋无脊椎动物血细胞悬液的制备方法,其特征在于:所述的海洋贝类选自合浦珠母贝、企鹅贝、牡蛎、扇贝、鲍鱼、文蛤;所述的海洋节肢动物选自对虾、锯缘青蟹。
3.根据权利要求1所述的一种海洋无脊椎动物血细胞悬液的制备方法,其特征在于:步骤2)的改良抗凝剂和步骤3)的平衡盐溶液是现配现用。