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专利号: 2021113231432
申请人: 浙江海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-10-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种金枪鱼鱼卵的二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽,其特征在于所述寡肽为九肽化合物,其氨基酸序列为Glu‑Ile‑Pro‑Gly‑Thr‑Arg‑Gly‑Pro‑Leu,ESI‑MS测定分子量为939.07Da。

2.根据权利要求1所述一种金枪鱼鱼卵的二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽的制备方法,其特征在于包括下述步骤:

1)鱼卵的预处理:金枪鱼鱼卵解冻,去杂,组织捣碎机捣碎,加入丙酮溶液,200W超声

15‑20min脱脂,重复三次,于4℃、9000rmp离心15~20min,固体沉淀干燥,得脱脂鱼卵;

2)鱼卵的酶解:将上述脱脂鱼卵加入到pH 1.5~2.5缓冲液中,搅匀,溶液调温至37℃,加入脱脂鱼卵重量2.0~2.5%蛋白酶A,酶解3~4h;然后调溶液pH至6.5~7.5,加入脱脂鱼卵重量2.0~2.5%蛋白酶B,酶解4~5h;酶解结束后,溶液冷却至室温,于12000rmp离心10~15min,收集上清液,得金枪鱼鱼卵蛋白酶解液;

3)鱼卵二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽的制备:将上述金枪鱼鱼卵蛋白酶解液经截留分子量为

3.0和1.0kDa的超滤膜进行分级,收集分级组分,测定各组分对二肽基肽酶Ⅳ的抑制作用,选择活性最好的组分依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP‑HPLC)纯化,得到二肽基肽酶Ⅳ(DPP‑IV)抑制寡肽。

3.根据权利要求2所述一种金枪鱼鱼卵的二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽的制备方法,其特征在于所述的步骤1)中的金枪鱼为鲣鱼Katsuwonus pelamis。

4.根据权利要求2所述一种金枪鱼鱼卵的二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽的制备方法,其特征在于所述步骤1)中的捣碎后的鱼卵与丙酮的重量体积比为1g:8~10mL。

5.根据权利要求2所述一种金枪鱼鱼卵的二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽的制备方法,其特征在于所述步骤2)中脱脂脂鱼与缓冲液的重量体积比为1g:10~12mL。

6.根据权利要求2所述一种金枪鱼鱼卵的二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽的制备方法,其特征在于所述步骤2)中缓冲液为磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求2所述一种金枪鱼鱼卵的二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽的制备方法,其特征4

在于所述的步骤2)中的蛋白酶A为胃蛋白酶,酶活力≥1.5×10U/g。

8.根据权利要求2所述一种金枪鱼鱼卵的二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽的制备方法,其特征4

在于所述的步骤2)中的蛋白酶B为胰蛋白酶,酶活力≥2.0×10U/g。

9.根据权利要求2所述一种金枪鱼鱼卵的二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽的制备方法,其特征在于所述步骤3)中的凝胶柱层析步骤为:将上述活性最好的超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为35~40mg/mL的溶液,经过Sephadex G‑15柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,流速0.6mL/min,根据215nm下色谱图收集各色谱峰,测定各个色谱峰的二肽基肽酶Ⅳ抑制作用;选择活性最高色谱峰样品,配成浓度为15~20mg/mL的溶液,经过 Peptide 10/300GL分离,用双蒸水进行洗脱,流速

0.6mL/min,根据215nm下色谱图收集各色谱峰,测定各个色谱峰的二肽基肽酶Ⅳ抑制作用,得凝胶层析酶解物。

所述步骤3)中的RP‑HPLC纯化步骤为:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成35~40μg/mL的溶液,利用RP‑HPLC进行纯化,根据制备寡肽的活性得1个高二肽基肽酶Ⅳ抑制作用的寡肽Glu‑Ile‑Pro‑Gly‑Thr‑Arg‑Gly‑Pro‑Leu,ESI‑MS测定分子量为939.07Da。

进一步优选,所述RP‑HPLC条件为:进样量10μL;色谱柱Kromasil C‑18(250mm×4.6mm,

5μm);流动相:50%乙腈;洗脱速度0.6mL/min;紫外检测波长215nm。

10.如权利要求1所述一种金枪鱼鱼卵的二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽用于制备治疗或者辅助治疗II型糖尿病的特殊医学用途食品、保健产品和药物中的用途。