1.一种miRNA检测方法,其特征在于,该方法为:在细胞内环境下,当待检测的目标miRNA存在时,该目标miRNA诱导底物探针和染料探针发生熵驱动的循环反应,生成RNA适配体Corn的G‑4链体结构,使得体系中本来无荧光的DFHO产生荧光,从而通过检测体系的荧光强度实现目标miRNA的检测。
2.一种miRNA成像方法,其特征在于,该方法为:在细胞内环境下,当目标miRNA存在时,该目标miRNA诱导底物探针和染料探针发生熵驱动的循环反应,生成RNA适配体Corn的G‑4链体结构,使得体系中本来无荧光的DFHO产生荧光,从而通过荧光成像系统实现目标miRNA的成像。
3.一种用于miRNA检测和成像的组合物,其特征在于,其用于采用权利要求1的方法对目标miRNA进行检测和/或采用如权利要求2的方法对目标miRNA进行成像。
4.根据权利要求3所述的用于miRNA检测和成像的组合物,其特征在于,目标miRNA为miRNA‑141,序列为:
5’‑UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG‑3’;
该组合物包括:
引物探针OB,其序列为:
5’‑CGAAGAAGGA GGTCTGAGGAGGTCACTG‑3’;
引物探针SB,其序列为:
5’‑CCACATACATCATATT AACT TAACACTGTCTGGTAA‑3’;
引物探针LB,其序列为:
5’‑CCATCTTTACCAGACAGTGTTAAGTTCAGTGACCTCCTCAGACC‑3’;
以及染料探针F,其序列为:
5’‑GGTCTGAGGAGGTCACTGAACTTAACACTGTCTGGTAA‑3’;
其中,引物探针OB、SB、LB用于杂交合成底物探针S,底物探针S和染料探针F作为反应物,当目标miRNA存在时,在熵驱动的作用下,目标miRNA不断的催化熵驱动的链取代反应,使染料探针F取代底物探针S中的引物探针OB和SB两条链,从而使引物探针OB从底物探针S中游离到反应体系的溶液中,游离的引物探针OB与反应体系中加入的DFHO结合,形成RNA适配体Corn的G‑4链体结构,从而本来无荧光的DFHO产生荧光;最终能够通过检测体系的荧光强度实现目标miRNA的检测,以及通过荧光成像系统实现目标miRNA的成像。
5.一种用于miRNA检测和成像的试剂盒,其特征在于,其包括如权利要求4所述的组合物。
6.根据权利要求5所述的用于miRNA检测和成像的试剂盒,其特征在于,该试剂盒还包括TE缓冲液、不含RNA酶的离心管、MgCl2溶液、opti‑MEM培养基、lipo3000溶液。
7.根据权利要求6所述的用于miRNA检测和成像的试剂盒,其特征在于,该试剂盒用于目标miRNA检测或成像的方法包括以下步骤:
1)合成底物探针S:
分别用TE缓冲液配制引物探针OB溶液、引物探针SB溶液和引物探针LB溶液,然后将三种引物探针溶液加入到不含RNA酶的离心管中,混合均匀后再加入MgCl2溶液,加热,之后冷却至室温,最后用DNA纯化试剂盒纯化后,干燥得到底物探针S的干粉;
2)制备质粒包裹的底物探针S和染料探针F:分别取底物探针S干粉、染料探针F用opti‑MEM培养基溶解并配制成底物探针S溶液和染料探针F溶液,另取lipo3000溶液用opti‑MEM培养基稀释,将探针S溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到A混合液,将染料探针F溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到B混合液,静置备用;
3)对包含目标miRNA的细胞进行培养;
4)对培养后的细胞进行目标miRNA检测:将A混合液、B混合液与培养后的细胞混合进行孵育,之后用PBS溶液清洗去除多余的探针,再加入DFHO溶液继续孵育,然后再用PBS溶液清洗去除多余的DFHO溶液;
最后检测细胞的荧光强度,实现目标miRNA的检测;或者通过采集细胞的荧光图像实现目标miRNA成像。
8.根据权利要求7所述的用于miRNA检测和成像的试剂盒,其特征在于,该试剂盒用于目标miRNA检测或成像的方法包括以下步骤:
1)合成底物探针S:
分别用TE缓冲液配制引物探针OB溶液、引物探针SB溶液和引物探针LB溶液,然后将三种引物探针溶液加入到不含RNA酶的离心管中,混合均匀后再加入MgCl2溶液,加热至95℃,并保持5分钟,之后冷却至室温,最后用DNA纯化试剂盒纯化后,干燥得到底物探针S的干粉;
2)制备质粒包裹的底物探针S和染料探针F:分别取底物探针S干粉、染料探针F用opti‑MEM培养基溶解并配制成底物探针S溶液和染料探针F溶液,另取lipo3000溶液用opti‑MEM培养基稀释,将探针S溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到A混合液,将染料探针F溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到B混合液,静置15min备用;
3)对包含目标miRNA的细胞进行培养;
4)对培养后的细胞进行目标miRNA检测或成像:将A混合液、B混合液与培养后的细胞混合孵育5小时,之后用PBS溶液清洗去除多余的探针,再加入DFHO溶液继续孵育30min,然后再用PBS溶液清洗去除多余的DFHO溶液;
最后通过检测细胞的荧光强度,实现目标miRNA的检测;或者通过采用共聚焦显微镜采集细胞的荧光图像实现目标miRNA成像。
9.根据权利要求7或8所述的用于miRNA检测和成像的试剂盒,其特征在于,所述步骤3)中的细胞为包含目标miRNA的MCF‑7细胞,进行细胞培养的方法为:将MCF‑7细胞用RPMI‑
1640培养液培养,培养液中添加了胎牛血清、青霉素和链霉素;细胞置于含有5%CO2的37℃5
的培养箱中培养;将融合度大于90%的细胞以5×10 浓度接种培养皿中,在培养箱中培养过夜。