1. 一种非诊断目的的体外活细胞中lncRNA HOTAIR的检测方法,其特征在于:所述检测方法的步骤为:(1)制备错配线性双链寡核苷酸探针:
所述错配线性双链寡核苷酸探针由5'端用BHQ1修饰的捕获探针和3'端用FAM修饰的报告探针组成;捕获探针与报告探针部分杂交,形成具有两个错配碱基的错配线性双链寡核苷酸探针;
(2)制备 Opti‑MEM转染混合物: 将所述错配线性双链寡核苷酸探针、转染试剂和Opti‑MEM混合,制备得到Opti‑MEM转染混合物;
(3)将活细胞与所述Opti‑MEM转染混合物在加湿环境下进行孵育,获得孵育后的细胞;
以及
(4)对所述孵育后的细胞进行激光扫描显微镜成像;
在没有靶标lncRNA HOTAIR的情况下,所述错配线性双链寡核苷酸探针结构的形成使猝灭剂BHQ1和荧光团FAM靠近,从而有效地猝灭荧光,处于OFF状态;在靶标lncRNA HOTAIR存在的情况下,所述错配双链寡核苷酸探针中的捕获探针与靶标lncRNA HOTAIR完全杂交并释放报告探针,从而在激发时发射荧光,处于ON状态,实现对靶标lncRNA HOTAIR的检测;
在没有靶标lncRNA HOTAIR的情况下,所述错配线性双链寡核苷酸探针在37℃的生理温度下保持稳定,并且在37℃下区分完全匹配的靶标lncRNA HOTAIR;
所述lncRNA HOTAIR的序列为5'‑GCA ACU CUA UAAUAU GCU UAU AUU AGG UCU AGA AG‑3';
所述报告探针的序列为5'‑G*C*T* TAT TTT AGG ACT *A*G*A‑FAM‑3', 其中,*代表硫代修饰的寡核苷酸,所述_代表错配的碱基;
所述捕获探针的序列为5'‑BHQ1‑T* C*T*A* G*AC CTA ATA TAA GCA TAT TAT AGA G*T*T *G*C‑3' , 其中,*代表硫代修饰的寡核苷酸;
所述错配线性双链寡核苷酸探针能区别不同活细胞中lncRNA HOTAIR表达量的不同,将癌细胞与正常细胞区分开来,且能检测到正常细胞中低表达量的lncRNA HOTAIR。
2. 如权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述步骤(2),将转染试剂Lipofectamine 3000稀释在Opti‑MEM中形成A溶液,在Opti‑MEM中稀释所述错配线性双链寡核苷酸探针和转染试剂P3000形成B溶液,混合A溶液和B溶液,进行孵育,制备得到 Opti‑MEM转染混合物。
3.如权利要求2所述的检测方法,其特征在于:所述孵育为在室温下孵育10‑20分钟。
4.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述步骤(3)中,所述孵育为在含有5% CO2的加湿培养箱中于35‑37℃下孵育2‑3小时。
5.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述步骤(4)中,采用488nm波长激发FAM的荧光点。
6.一种非诊断目的的体外lncRNA HOTAIR的检测方法,其特征在于:所述检测方法的步骤为:(1)制备错配线性双链寡核苷酸探针:
所述错配线性双链寡核苷酸探针由5'端用BHQ1修饰的捕获探针和3'端用FAM修饰的报告探针组成;捕获探针与报告探针部分杂交,形成具有两个错配碱基的错配线性双链寡核苷酸探针;
(2)将RNA样品与所述错配线性双链寡核苷酸探针混合,黑暗中孵育,以释放报告探针;
以及
(3)将释放的报告探针进行荧光光谱测量;
在没有靶标lncRNA HOTAIR的情况下,所述错配线性双链寡核苷酸探针结构的形成使猝灭剂BHQ1和荧光团FAM靠近,从而有效地猝灭荧光,处于OFF状态;在靶标lncRNA HOTAIR存在的情况下,所述错配双链寡核苷酸探针中的捕获探针与靶标lncRNA HOTAIR完全杂交并释放报告探针,从而在激发时发射荧光,处于ON状态,实现对靶标lncRNA HOTAIR的检测;
在没有靶标lncRNA HOTAIR的情况下,所述错配线性双链寡核苷酸探针在37℃的生理温度下保持稳定,并且在37℃下区分完全匹配的靶标lncRNA HOTAIR;
所述lncRNA HOTAIR的序列为5'‑GCA ACU CUA UAA UAU GCU UAU AUU AGG UCU AGA AG‑3';
所述捕获探针的序列为5'‑BHQ1‑T* C*T*A* G*AC CTA ATA TAA GCA TAT TAT AGA G*T*T *G*C‑3',其中,*代表硫代修饰的寡核苷酸;
所述报告探针的序列为 5'‑ G*C*T* TAT TTT AGG ACT *A*G*A‑FAM‑3',其中,*代表硫代修饰的寡核苷酸,所述_代表错配的碱基。
7.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于:所述步骤(1)中,将捕获探针和报告探针分别在1×反应缓冲液中稀释,然后在90‑95℃下孵育5‑8min,缓慢冷却至室温形成所述错配线性双链寡核苷酸探针。
8.如权利要求7所述的检测方法,其特征在于:所述1×反应缓冲液的组成为10mM Tris‑HCl和50mM NaCl,pH为8.0。
9.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于:所述步骤(2)中,将RNA样品与所述错配线性双链寡核苷酸探针和RNase抑制剂加入到10×TDT缓冲液中进行混合获得混合物,再将所述混合物在35‑40℃下黑暗中孵育2‑3小时以释放报告探针。
10. 如权利要求9所述的检测方法,其特征在于:所述10×TDT缓冲液的组成为100 mM Mg(Ac)2、200mM Tris‑Ac和500mM KAc,pH为7.9。
11.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于:所述步骤(3)中,荧光激发波长为
488nm,发射光谱在500至650nm范围内扫描,收集520nm处的发射强度用于数据分析。