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专利号: 2021109720703
申请人: 南通大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用,其特征在于,包括以下步骤:步骤1)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA引物,引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示,构建慢病毒载体lbr‑shRNAi‑1和lbr‑shRNAi‑2;

步骤2)、体外慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预;

21)神经干细胞的获取及传代:取分离的大鼠神经干细胞在培养基中进行传代,原代培养物生长5天,神经干细胞每4天传代一次,取第2‑4代的神经干细胞用于所有实验;

22)取步骤1)所构建的慢病毒载体lbr‑shRNAi‑1和lbr‑shRNAi‑2,其MOI=10,分别对步骤21)获取的第2‑4代的神经干细胞进行转染;12小时后加入500μl完全培养基;病毒转染后72小时,检测神经干细胞中的GFP表达以确定病毒滴度;

步骤3)、体内慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预;

31)在小鼠脊髓损伤后1‑2周分别注射步骤22)经病毒转染后的神经干细胞10万‑100万个;

32)在神经干细胞体内移植后的2‑8周内,利用慢病毒介导的核膜蛋白敲降,即通过微

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量注射泵进行慢病毒载体的注射,注射浓度为10‑10/μL,注射体积为0.5μL‑4μL;

33)损伤后6周对小鼠灌流固定,取相应脊髓节段,30μm连续切片,每个样品随机取3张切片进行免疫组化,对神经干细胞的分裂分化进行鉴定。

2.根据权利要求1所述一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用,其特征在于,所述步骤1)包括以下步骤:

11)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA引物,引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示,并合成相关引物;

12)、正反义寡核苷酸链退火;按以下体系配制退火反应体系:

1ug/μl正义寡核苷酸链5μl;

1ug/μl反义寡核苷酸链5μl;

ddH2O 15μl;

反应条件:95℃,反应5分钟,后缓慢降至室温,得到退火后的寡核苷酸双链;

其中,lbr‑shRNAi‑1的正义寡核苷酸链如SEQ ID No.3所示;对应的反义寡核苷酸链SEQ ID No.4所示;

lbr‑shRNAi‑2的正义寡核苷酸链如SEQ ID No.5所示;对应的反义寡核苷酸链SEQ ID No.6所示;

13)、用AgeI和EcoRI双酶切线性化质粒GV112,得到改造后的线性化载体;酶切体系是:反应条件:37度3小时

14)、连接步骤12)退火形成的寡核苷酸双链与步骤13)所得改造后的线性化载体,得到重组质粒;按照以下体系配制连接反应体系:反应条件:4℃过夜;

15)、转化及鉴定

将步骤14)连接所得的重组质粒导入感受态的大肠杆菌体内,以从含有抗生素的LB平板上挑取单菌落,进行测序;

16)、将上述连接重组的质粒和包装辅助质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0,转染到293T细胞中产生复制缺陷型慢病毒;收集上清液,并离心浓缩,纯化得到慢病毒载体;通过测量共表达的GFP确定病毒滴度。

3.根据权利要求2所述一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用,其特征在于,所述步骤15)中鉴定包括以下步骤:

151)配制如下反应体系,震荡混匀,短暂离心;

ddH2O 9.2ul

2×Taq Plus Master Mix 10ul上游引物:10μM,0.4ul;序列如SEQ ID No.7所示;

下游引物:10μM,0.4ul;序列如SEQ ID No.8所示;

单菌落–

PCR反应条件:94℃,3min;94℃30s,55℃30s,72℃30s共22cycles;72℃3min;4℃∞;

152)在超净工作台中,用无菌的枪头挑单个菌落至20μL至鉴定体系中,吹打混匀,置于PCR仪中进行反应,反应体系共20ul;

153)将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中,37℃培养12‑16h,取适量菌液进行测序,测序引物如SEQ ID No.8所示;若测序结果含SEQ ID No.1和SEQ ID No.2则成功。

4.根据权利要求1所述一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用,其特征在于,所述步骤21)中培养基包括:DMEM/F12、1X B27、1X PS、20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF。

5.根据权利要求1所述一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用,其特征在于,所述步骤22)中完全培养基包括:DMEM/F12、1X B27、1XPS、50ng/ml EGF和50ng/ml bFGF。