1.一种基于核酸外切酶辅助放大光电化学适配体传感器检测单增李斯特菌的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1、制备WO3/FTO电极
将掺杂氟的SnO2导电玻璃(FTO)先后用丙酮、氢氧化钠、去离子水清洗,烘干备用。将
0.4g Na2WO4·2H2O和0.17g(NH4)2C2O4·H2O溶解于33mL去离子水中,搅拌10min后,加入9mL HCl溶液(37%)。再搅拌10min加入8mLH2O2(30%),继续搅拌20min,加入30mL无水乙醇并搅拌30min。将预处理的FTO导电面朝下,倾斜45°靠近烧杯杯壁,置于上述溶液中,放入水浴锅中一定温度下保持200min。降至室温后,用去离子水冲洗干净,然后置于60℃干燥箱中干燥
6h。最后用马弗炉一定温度下煅烧2h,冷却至室温后用去离子水冲洗并干燥,得到WO3/FTO电极;
步骤2、CdTe量子点(CdTe QDs)的制备
0.2mmol的CdCl2·2.5H2O溶解于50mL去离子水中,然后加入18μL巯基乙酸并搅拌
10min,然后用2M NaOH调节pH。将0.04mmol的K2TeO3溶解于50mL去离子水中,充分搅拌后加入上述溶液中,并搅拌20min。然后加入80mg NaBH4充分反应5min。然后将烧瓶连接冷凝器在100℃条件下冷凝一定时间。冷却至室温后离心洗涤,最后加入等量去离子水置于4℃冰箱中保存;
步骤3、CdTe QDs‑适配体(CdTe QDs‑Ap)偶联物的制备
400μL CdTe QDs用40μL含有40mM 1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和10mM N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液在室温下活化1h,然后加入300μL一定浓度的单核增生李斯特菌(LM)适配体(Ap)溶液中,持续搅拌过夜。所得溶液在4℃离心除去过量Ap,即得到CdTe QDs‑Ap偶联物;
步骤4、构建光电化学适配体传感器工作电极首先将WO3/FTO电极浸入0.01M HAuCl4(pH=4.5)溶液中50min,于300℃下煅烧2h形成金纳米颗粒,得Au/WO3/FTO电极。
将2μM LM适配体的互补DNA(cDNA)用三(2‑羧乙基)膦(TCEP)(0.6μL,10mM)活化1h,滴在Au/WO3/FTO电极上。在4℃下孵化过夜,并用Tris‑HCl(pH=7.4,10mM)缓冲液冲洗,然后用30μL 6‑羟基‑1‑己硫醇(MCH)封闭1h。Tris‑HCl冲洗后,将30μL CdTe QDs‑Ap偶联物滴在电极上,并在37℃下孵育1h使Ap与cDNA杂交。用Tris‑HCl溶液冲洗后即得工作电极;
步骤5、构建检测LM的光电化学适配体传感器将步骤4制备的工作电极插入电解槽中,再将饱和甘汞电极和铂对电极插入,组成三电极体系,外接电化学工作站,辅以氙灯光源系统模拟太阳光,即组装成了光电化学适配体传感器,用于LM的光电化学检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于核酸外切酶辅助放大光电化学适配体传感器检测单增李斯特菌的方法,其特征在于,步骤1中,水浴锅温度为70‑90℃,马弗炉煅烧温度为300‑
800℃。
3.根据权利要求1所述的一种光电化学适配体传感器的制备方法及应用,其特征在于,步骤2中,溶液pH值为10‑11.5,冷凝时间为1‑10h。
4.根据权利要求1所述的一种光电化学适配体传感器检测单增李斯特菌的方法,其特征在于,步骤3中,LM适配体浓度为1‑5μM。
5.根据权利要求1所述的一种光电化学适配体传感器检测单增李斯特菌的方法,其特征在于,单核增生李斯特菌含量确定方法:△I=9.76logC‑4.44
式中,△I为检测时修饰致病菌前后的电流变化量,单位为毫安,C为沙门氏菌浓度,单位为CFU/mL。
6.根据权利要求5所述的一种基于核酸外切酶辅助放大光电化学适配体传感器检测单增李斯特菌的方法,其特征在于,光电化学检测是在室温下用含有0.1M抗坏血酸(AA)的磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.4,0.1M)进行。测试过程中由模拟日光氙灯系统提供光源,光源每20s开关一次。外加电压为0.0V。
7.根据权利要求1‑6任一项所述的方法所制备的光电化学适配体传感器,用于单核增生李斯特菌的快速检测,也适用于其它食源性致病菌的快速检测。