1.一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒,其特征在于,包括:抗体预包被酶标板、ELA2‑DNA标准品、样品稀释液、Anti‑DNA‑POD抗体、ABTS溶液、ABTS终止溶液和洗涤液,其中,所述抗体预包被酶标板由纯化抗人ELA2抗体包被制成;所述ELA2‑DNA标准品是多个肺癌肝转移患者的混合血清;所述样品稀释液包括磷酸盐缓冲液和调节酸碱度的盐酸;所述洗涤液为PBST溶液。
2.根据权利要求1所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒,其特征在于,所述样品稀释液具体包括:NaC1、KCl、Na2HPO4和KH2PO4、HCl和双蒸水。
3.根据权利要求1所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒,其特征在于,所述ABTS溶液具体包括:ABTS二胺盐溶液和二硫酸钾溶液;所述ABTS终止溶液具体包括:十二烷基硫酸钠和去离子水;所述PBST溶液为含0.05%Tween20的1×磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒,其特征在于,所述预包被酶标板为96孔聚苯乙烯透明微孔板。
5.一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法,其特征在于,包括:纯化抗人ELA2抗体用0.01mol/L pH 9.5的碳酸盐缓冲液稀释成5μg/ml,按每孔100μl的量包被ELISA微孔板,4℃过夜;
包被步骤完成后,去除ELISA微孔板内的包被液,按每孔160μl的量加入1%BSA封闭液,
4℃封闭过夜;
封闭步骤完成后,去除所述ELISA微孔板内的封闭液后制成抗体预包被酶标板;
收集肺癌肝转移患者血液样本,在4℃温度条件下以3000rmp的速率离心10min,取上清,制成血清样本;
将所述血清样本进行5倍稀释,制成稀释样本;
清洗所述预包被酶标板,每孔加入100μl所述稀释样本,设置阴性孔,封板后在25℃温度条件下,以250rmp的速率震荡,孵育120min;
孵育完成后洗板并拍干;
将Anti‑DNA‑POD抗体用样品稀释液20倍稀释,加入反应孔,每孔100μl,封板后在25℃温度条件下,以300rmp的速率震荡,孵育120min;
反应完成后洗板并拍干;
每孔加入100μlABTS溶液,设置空白孔,封板后在25℃温度条件下,以250rmp的速率震荡,孵育20~30min;
待显色均匀,在每孔加入100μl ABTS终止溶液终止反应,并于405nm处测定OD值;
根据ELA2‑DNA含量数值,将多个肺癌肝转移患者的血清混合;
另取一酶标板,将纯化的1μg/ml的小牛胸腺DNA作为检测混合血清样本中游离DNA的标准品,使用TE缓冲液稀释1μg/ml小牛胸腺DNA,调整体积为50μl加入酶标板,再向每孔加入
50μl的2×PicaGreen试剂,使终体系为100μl;
使用TE缓冲液将混合的血清样本分别做0倍稀释、5倍稀释、25倍稀释,向酶标板中每孔加入50μl的混合血清样本,再向每孔加入50μl的2×PicaGreen试剂,使终体系为100μl;
避光于室温下放置2min~5min,使用多功能酶标仪选择蓝色激发光,检测样品中游离DNA含量;
对小牛胸腺DNA浓度与OD值进行一元一次方程回归拟合标准曲线,回归方程的相关系2
数R>0.9500;将混合血清样本的OD值代入标准曲线计算出混合血清样本中的游离DNA浓度,并调整为200ng/ml,制成ELA2‑DNA标准品。
6.根据权利要求5所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法,其特征在于,还包括:
称取8g NaC1、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于900ml双蒸水中,用盐酸调pH值至7.4,加水定容至1L,121℃、0.1MPa高压灭菌20min后,制成样品稀释液,室温贮藏备用。
7.根据权利要求5所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法,其特征在于,还包括:
将7mmol/L ABTS二胺盐溶液和4.9mmol/L二硫酸钾(K2S2O8)溶液等体积混合,避光放置
12h,用无水乙醇在分光光度计A734nm下调节OD值至0.7,制成ABTS溶液,避光储存备用。
8.根据权利要求5所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法,其特征在于,还包括:
将1g十二烷基硫酸钠(SDS)溶解在100ml去离子水中,制成ABTS终止溶液,储存备用。
9.根据权利要求5所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法,其特征在于,还包括:
配制含0.05%Tween20的1×磷酸盐缓冲液,制成洗涤液。
10.一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒的使用方法,其特征在于,包括:取出抗体预包被酶标板恢复至室温,洗板拍干;
将标准品使用样品稀释液按浓度200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、
6.25ng/ml、3.125ng/ml、0ng/ml进行稀释备用;
将血清样本使用样品稀释液进行5倍稀释备用;
抗体预包被酶标板中每孔加入100μl梯度浓度标准品或血清样本,设置阴性孔,封板后在25℃温度条件下,以250rmp的速率震荡,孵育120min;
洗板3次并拍干;
将Anti‑DNA‑POD抗体用样品稀释液20倍稀释,加入反应孔,每孔100μl,封板后在25℃温度条件下,以300rmp的速率震荡,孵育120min;
洗板3次并拍干;
每孔加入100μlABTS溶液,设置空白孔,封板后在25℃温度条件下,以250rmp的速率震荡,孵育20min~30min;
待显色均匀后,每孔加入100μl ABTS终止溶液终止反应,并于405nm处测定OD值;
绘制标准曲线,样本中的ELA2‑DNA含量通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度数据;
根据所述浓度数据确定是否出现肺癌肝转移。