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专利号: 2021100692479
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-03-19
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种同时检测多种长链非编码RNA的复合物,其特征在于:包括磁珠、报告单元和生物素化的捕获探针;报告单元、捕获探针至少为两个;报告单元是由辅助探针、荧光团标记的信号探针A和荧光团标记的信号探针B的DNA杂交链反应构建的长一维DNA连接体,其中,辅助探针与部分信号探针A杂交,信号探针A和信号探针B彼此相互交替杂交;

所述捕获探针的3’端标记有biotin生物素并与磁珠相连,捕获探针的5’端与报告单元杂交形成部分互补双链。

2.如权利要求1所述的复合物,其特征在于:所述荧光团为适用于分子检测的能够产生发光信号的分子,包括Cy3、Cy5荧光团。

3.权利要求1或2所述的复合物在检测长链非编码RNA中的应用;

优选的,所述长链非编码RNA至少为两个;

进一步优选的,所述长链非编码RNA包括lncRNA MALAT1和lncRNA HOTAIR。

4.一种同时检测多种长链非编码RNA的方法,其特征在于:具体包括:(1)制备权利要求1中所述的同时检测多种长链非编码RNA的复合物;

(2)进行细胞培养和总RNA提取;

(3)长链非编码RNA测定,并进行磁分离释放荧光团;

(4)进行荧光检测,收集荧光信号;

(5)进行单分子检测和数据分析;

(6)活细胞中MB捕获探针‑报告单元复合物的实时成像。

5.如权利要求4所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)中,先制备报告单元,再将捕获探针与链霉亲和素包被的磁珠缀合,然后进行MB捕获探针‑报告单元复合物的制备。

6.如权利要求5所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)中,使用的所有探针均为线性链DNA。

7.如权利要求4所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)中,所述细胞为MCF‑7细胞、HeLa细胞、SW480细胞、A549细胞或HBE细胞中的一种或多种。

8.如权利要求4所述的方法,其特征在于:所述步骤(3)中,长链非编码RNA测定在室温下进行。

9.如权利要求4所述的方法,其特征在于:所述步骤(5)具体为:用缓冲液稀释反应产物后,将样品放在盖玻片上利用全内反射荧光显微镜进行单分子荧光成像;

所述缓冲液为Tris‑HCl、氯化钾、氯化镁和Trolox,pH 8.0组成的混合物,Tris‑HCl、氯化钾、氯化镁和Trolox,pH 8.0的摩尔比为10:5:5:1。

10.如权利要求4所述的方法,其特征在于:所述步骤(6)中,将MCF‑7细胞接种在玻璃底细胞培养皿中,并在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中孵育过夜,用1×PBS洗涤细胞两次,使用Lipofectamine 3000试剂进行转染测定;转染后,将细胞用1×PBS洗涤五次,并在培养皿中加入含有10%胎牛血清的新鲜DMEM培养基,细胞图像在具有10倍物镜的倒置显微镜上获得。