利索能及
我要发布
收藏
专利号: 2021100086619
申请人: 赣南师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-10-22
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法,其特征在于:本方法以斑马鱼为研究对象,包括步骤一:哒螨灵对斑马鱼胚胎毒性分析

S1.对斑马鱼胚胎进行哒螨灵类药物暴露;

所述的步骤S1的具体过程包括:

S101.在体式显微镜下观察并选择受精后6小时发育良好的斑马鱼胚胎,转移到6孔板中,每孔20个胚胎,进行哒螨灵暴露;

S102.在28.5±0.5℃条件下,分别用浓度为20、40、80、160、320、640和1280μg/L的哒螨灵溶液进行暴露实验,统计24h、48h、72h和96h的斑马鱼胚胎死亡数量,分析哒螨灵在不同暴露时长的半致死浓度;

S103.将受精后6小时发育良好的斑马鱼胚胎暴露于浓度为20、30、40 μg/L哒螨灵溶液中,于72hpf时结束哒螨灵暴露,并检测心脏毒性及机理;

S104.将12、24、36、48和60hpf的发育良好的斑马鱼胚胎暴露于40μg/L哒螨灵溶液中,并连续暴露12小时,然后更换为普通鱼液,并72hpf时检测心脏毒性及机理;

S2.观察哒螨灵对斑马鱼心脏形态和功能的量化;

所述的步骤S2的具体过程包括:

S201.在72小时对斑马鱼进行去壳后拍摄心脏表型,并测量心脏和心包面积、静脉窦与动脉球的距离;

S202.在48和72hpf时统计心脏的心跳节律和快慢;

步骤二:哒螨灵对斑马鱼发育的表型记录

S3.对斑马鱼心脏切片,进行组织病理学研究;

所述的步骤S3的具体过程包括:

S301.多聚甲醛固定:在72hpf时,将斑马鱼心脏用PFA在4℃固定过夜,再用1×PBS漂洗

3次,每次5分钟;

S302.酒精脱水:按照70%乙醇清洗5次,每次5分钟,80%乙醇清洗1次,每次5分钟,90%乙醇清洗1次,每次5分钟,95%乙醇清洗1次,每次5分钟,100%乙醇清洗2次,每次10分钟,对斑马鱼心脏进行脱水;

S303.透明:脱完水后先用1/2乙醇与1/2二甲苯混合液处理20分钟,再用二甲苯透明5‑

10分钟;

S304.然后,进行石蜡包埋,具体步骤为:先用1/2二甲苯与1/2石蜡混合液加入有斑马鱼组织的试管中,在65℃烘箱放置 30‑50 min,然后将液体更换为石蜡后再放置30 min‑

1h;

S305.最后,利用切片机将斑马鱼切成5‑7μm切片,制备斑马鱼心脏组织切片;

S306.苏木精和伊红染色:石蜡切片用苏木精和伊红染色,并用中性树脂密封,使用显微镜观察组织病理学变化;

S307.使用Tg转基因细胞系在共聚焦激光扫描显微镜观察心脏内红细胞数量;

步骤三:哒螨灵对斑马鱼心脏毒性机理

S4.测定斑马鱼的氧化应激分析;S5.检测哒螨灵暴露诱导的斑马鱼细胞凋亡;S6.检测斑马鱼基因转录水平。

2.根据权利要求1所述的一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法,其特征在于:所述的步骤S4的具体过程包括:

S401.将72hpf的活斑马鱼用鱼液洗涤除去哒螨灵残留,然后在20μM DCFH‑DA探针中28℃避光孵育30min;

S402.然后用鱼液洗涤3次,除去多余的DCFH‑DA后,通过荧光立体显微镜在恒定设置下拍摄荧光显微图像;

S403.比较对照组和处理间荧光强度差异,研究处理组氧化应激水平;

S404.采用紫外可见分光光度法测定过氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性和丙二醛含量,每次处理收集50个胚胎,重复3次。

3.根据权利要求1所述的一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法,其特征在于:所述的步骤S5的具体过程包括:

S501.将72hpf的胚胎用鱼液洗涤,除去哒螨灵残留;

S502.将清洗后的胚胎用浓度为5mg/LAO的工作液在28.5℃暗箱中染色30 min,然后用鱼液洗涤3次;

S503.通过荧光立体显微镜对胚胎进行拍照,观察细胞凋亡。

4.根据权利要求1所述的一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法,其特征在于:所述的步骤S6的具体过程包括:

S601.使用TriZol试剂从每次处理的胚胎中提取总RNA,然后使用Prime Script®RT试剂盒对RNA进行逆转录;

S602.在荧光定量PCR仪上采用SYBR Green检测试剂盒定量检测基因转录水平,以β‑actin为内对照;

‑ΔΔCT

S603.使用2 方法显示基因表达的相对变化,且每次处理在72hpf收集30个胚胎,重复3次。

5.根据权利要求1所述的一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法,其特征在于:用于建立基于斑马鱼模型的快速鉴定农药心脏毒性的方法,快速检测哒螨灵。