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专利号: 2020112055636
申请人: 湖南师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种脊柱侧弯动物模型的建立方法,其特征在于,包括以下步骤:

基于靶点基因,合成gRNA和Cas9 mRNA,所述靶点基因与ccdc57基因的外显子对应,且序列如SEQ ID NO.1所示;

将所述gRNA和所述Cas9 mRNA载入至斑马鱼的胚胎中,获得F0胚胎;

F0胚胎培育至性成熟后与野生型斑马鱼交配获得F1胚胎,筛选有效突变胚胎培育至成年后获得相同基因型的有效敲除斑马鱼,将所述有效敲除斑马鱼进行自交获得F2胚胎,培育至成年筛选获得ccdc57纯合敲除斑马鱼。

2.根据权利要求1所述的脊柱侧弯动物模型的建立方法,其特征在于,所述gRNA的合成包括以下步骤:将T7启动子序列、靶点序列和gRNA scaffold前20个碱基序列融合,得到正向引物,所述正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示;将gRNA scaffold后20个碱基序列设计为反向引物,所述反向引物的序列如SEQ ID NO.3所示,gRNA scaffold序列如SEQ ID NO.4所示;

以插入gDNA固定序列的pMD18-T质粒为模板,以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3为引物,进行第一次扩增,得到gDNA;

以gDNA为模板合成gRNA。

3.根据权利要求2所述的脊柱侧弯动物模型的建立方法,其特征在于,所述第一次扩增的步骤为:94℃下保持2分钟后,进入32个循环,每个循环经历10秒98℃变性,30秒56℃退火,10秒68℃延伸。

4.根据权利要求1所述的脊柱侧弯动物模型的建立方法,其特征在于,所述Cas9 mRNA合成包括以下步骤:以XbaI内切酶线性化pT3.Cas9-UTRglobin质粒,再以线性化的质粒为模板,合成Cas9 mRNA。

5.根据权利要求1所述的脊柱侧弯动物模型的建立方法,其特征在于,所述将所述gRNA和所述Cas9 mRNA载入至斑马鱼的胚胎中的步骤包括:将gRNA和Cas9 mRNA混合稀释,使得各自最终浓度为50ng/ul和100ng/ul,将混合物注射到1-2细胞期野生型斑马鱼胚胎中。

6.根据权利要求2所述的脊柱侧弯动物模型的建立方法,其特征在于,所述获得F0胚胎和所述F0胚胎培育至性成熟之间还包括对F0胚胎进行敲除检测,所述敲除检测包括:将F0胚胎培养至出膜阶段,挑取胚胎,逐个提取基因组进行第二次扩增,测序检测靶点序列情况。

7.根据权利要求6所述的脊柱侧弯动物模型的建立方法,其特征在于,所述第二次扩增中以F0胚胎基因组为模板,正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.6所示。

8.根据权利要求7所述的脊柱侧弯动物模型的建立方法,其特征在于,所述第二次扩增的步骤为:

94℃下保持5分钟后,进入32个循环,每个循环经历95℃变性30秒、56℃退火30秒,72℃延伸30s,最后在72℃延伸5分钟,使产物充分延伸并完成加A尾过程。

9.根据权利要求1所述的敲除检测方法,其特征在于,所述筛选有效突变胚胎的步骤为:将F1胚胎培养至出膜阶段,挑取胚胎,逐个提取基因组进行第三次扩增,测序确定非三倍数突变的F1胚胎为有效突变胚胎。

10.根据权利要求1所述的敲除检测方法,其特征在于,所述培育至成年筛选可获ccdc57纯合敲除斑马鱼的步骤为:将具有相同非三倍数突变的F1斑马鱼进行交配,获得F2,培养至成年后经剪尾筛选可获得纯合非三倍数碱基插入/缺失的斑马鱼,即为纯合有效的ccdc57突变体斑马鱼。