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专利号: 2020110240261
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-30
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株,其特征在于,将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因,然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因中的一个或多个即得;

其中,所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1已送至中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2020年05月08日,保藏编号为CCTCC NO:M 2020108。

2.如权利要求1所述的基因工程菌株,其特征在于,所述phzO基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示;

所述外源phzH基因碱基序列如SEQ ID NO.2所示;

所述lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的碱基序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

3.权利要求1或2所述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的构建方法,其特征在于,所述方法包括:将绿针假单胞菌Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因,然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因中的一个或多个。

4.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,“所述phzO基因替换为外源的phzH基因”的具体步骤包括:敲除phzO基因后得菌株QPCA-1,然后将外源phzH基因导入菌株QPCA-1中。

5.如权利要求4所述的构建方法,其特征在于,所述敲除phzO基因步骤包括:i、扩增phzO基因片段的上下游同源臂;采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得phzO基因重组质粒;

ii、将phzO基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与绿针假单胞菌Qlu-1进行双亲杂交培养,从而将phzO基因重组质粒导入绿针假单胞菌Qlu-1;

iii、筛选阳性克隆,即得菌株QPCA-1。

6.如权利要求5所述的构建方法,其特征在于,扩增phzO基因片段上游同源臂的引物包括phzO-F1和phzO-R1,序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示;

扩增phzO基因片段下游同源臂的引物包括phzO-F2和phzO-R2,序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示;

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的phzO基因上下游融合片段序列如SEQ ID NO.12所示;

筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。

7.如权利要求4所述的构建方法,其特征在于,所述外源phzH基因导入菌株QPCA-1中具体方法为:i、以QPCA-1基因组为模板,以phzO-F1/phzO-R1-2,phzO-F2-2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U2及下游片段phzO-D2;以合成的phzH基因为模板,phzH-F1/phzH-R1为引物扩增片段phzH-2;以phzO-U2、phzO-D2、phzH-2为模板,以phzO-F1/phzO-R2为引物,扩增融合phzO基因上下游的phzH导入片段phzH-IN;将融合片段phzH-IN插入pK18mobsacB质粒中得phzH基因重组质粒;

ii、将phzH基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与菌株QPCA-1进行双亲杂交培养,从而将phzH基因重组质粒导入菌株QPCA-1;

iii、筛选阳性克隆,即得;

优选的,

phzO-F1和phzO-R1-2的序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.13所示;

phzO-F2-2和phzO-R2的序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.11所示;

phzH-F1和phzH-R1的序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示;

phzH-IN基因上下游融合片段的序列如SEQ ID NO.17所示;

筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。

8.如权利要求5或6所述的构建方法,其特征在于,敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的方法与敲除phzO基因的方法相同;

其中,敲除lon基因方法中,

扩增lon基因片段上游同源臂的引物包括lon-F1和lon-R1,序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示;

扩增lon基因片段下游同源臂的引物包括lon-F2和lon-R2,序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示;

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的lon基因上下游融合片段序列如SEQ ID NO.22所示;

其中,敲除rsmE基因方法中,

扩增rsmE基因片段上游同源臂的引物包括rsmE-F1和rsmE-R1,序列分别如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示;

扩增rsmE基因片段下游同源臂的引物包括rsmE-F2和rsmE-R2,序列分别如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示;

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的rsmE基因上下游融合片段序列如SEQ ID NO.27所示;

其中,敲除psrA基因方法中,

扩增psrA基因片段上游同源臂的引物包括psrA-F1和psrA-R1,序列分别如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示;

扩增psrA基因片段下游同源臂的引物包括psrA-F2和psrA-R2,序列分别如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示;

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的psrA基因上下游融合片段序列如SEQ ID NO.32所示;

其中,敲除parS基因方法中,

扩增parS基因片段上游同源臂的引物包括parS-F1和parS-R1,序列分别如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示;

扩增parS基因片段下游同源臂的引物包括parS-F2和parS-R2,序列分别如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示;

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的parS基因上下游融合片段序列如SEQ ID NO.37所示;

其中,敲除rpeA基因方法中,

扩增rpeA基因片段上游同源臂的引物包括rpeA-F1和rpeA-R1,序列分别如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示;

扩增rpeA基因片段下游同源臂的引物包括rpeA-F2和rpeA-R2,序列分别如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示;

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的rpeA基因上下游融合片段序列如SEQ ID NO.42所示。

9.权利要求1或2所述基因工程菌株和/或权利要求3-8任一项所述构建方法获得的基因工程菌在生产吩嗪-1-甲酰胺中的应用。

10.一种吩嗪-1-甲酰胺的生产方法,其特征在于,所述方法包括:将权利要求1或2所述基因工程菌株和/或权利要求3-8任一项所述构建方法获得的基因工程菌接种于发酵培养基中进行培养;

优选的,所述发酵培养基为KB培养基。