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专利号: 2020107203479
申请人: 南京师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-08-18
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法,其特征在于,将DNA探针连接在金电极上,然后将中间插有微囊藻毒素适配体的环状DNA序列与金电极上的DNA探针混合孵育形成复合物;其中,环形DNA序列的两个末端分别与金电极上的DNA探针互补;加入样品溶液与复合物进行共孵育,然后依次加入T4 DNA连接酶和Phi 29 DNA聚合酶,再通过检测加入离子后金电极的电流信号的强弱,实现对目标物的定量检测。

2.根据权利要求1所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:(a)将5’端修饰有巯基的DNA探针,加入缓冲液1中,避光室温下共孵育,还原二硫键;

(b)将得到的探针溶液与金电极在黑暗条件下进行孵育;

(c)将(b)所得产物浸没于11-巯基-1-十一醇溶液中进行钝化;

(d)将含有环形DNA的溶液与(c)所得溶液混合孵育,制备复合物,称为电化学传感器;

(e)将上述制得的传感器浸没于缓冲液1中,去除电极上未结合的DNA以及其他分子;

(f)将含有不同浓度的目标物的样品溶液与该电化学传感器进行共孵育;

(g)加入T4 DNA连接酶,与电极表面的DNA复合物在缓冲液2共孵育;

(h)将(g)所得产物与Phi29 DNA聚合酶浸没于缓冲液3中,在20-30℃的条件下反应;

(i)在电极表面加入[Fe(CN)6]3-/4-以及KCl,孵育;

(j)使用微分脉冲伏安法,经过20-30ms的脉冲时间测量不同样品的电流;

(k)根据[Fe(CN)6]3-/4-阴离子发生的氧化还原产生的电流量判断目标物的含量。

3.根据权利要求1所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法,其特征在于:DNA探针的序列:5’HS-GCTGGAAGCCGAAGGTCG-3’环状DNA序列:5’P-GCTTCCAGCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGCCGACCTTCG-3’。

4.根据权利要求2所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法,其特征在于,所述缓冲液1为含有三(2-羰基乙基)磷盐酸盐TCEP的Tris-HCl缓冲液。

5.根据权利要求2所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法,其特征在于,所述缓冲液2含有Tris-HCl、MgCl2、ATP、DTT,pH 7.2-7.7。

6.根据权利要求2所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法,其特征在于,所述缓冲液3含有Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4、DTT,pH 7.2-7.7。

7.根据权利要求2所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法,其特征在于,步骤(k)通过绘制测得的电流与电势的关系图来计算。