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专利号: 2020102174520
申请人: 江苏科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:无效专利
更新日期:2026-01-15
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种TRV2病毒载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将SEQ ID NO.11所示序列插入到TRV2载体的多克隆位点EcoRI和BamHI之间,得到载体TRV2-GT2;

(2)以Gateway系统的载体pGWB419为模板,扩增得到自杀基因ccdB表达模块,以同源重组方式将ccdB表达模块插入到上述TRV2-GT2载体的BsaI位点处,得到载体TRV2-GT2-ccdB。

2.根据权利要求1所述构建方法,其特征在于,步骤(2)所述扩增的引物包括ccdB-F5和ccdB-R5,其中ccdB-F5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,ccdB-R5的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

3.权利要求1或2所述构建方法得到的TRV2病毒载体在构建番茄基因敲除文库中的应用。

4.一种基于TRV2病毒载体的番茄基因敲除文库的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:人工合成多条靶标gRNA,各靶标gRNA退火为双链后,将全部靶标gRNA等摩尔量混合,形成靶标gRNA文库,将此gRNA文库与经过BsaI酶切过的TRV2-GT2-ccdB载体在T4 DNA连接酶体系中进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5а,涂布LB平板后,收集LB平板的菌落,扩繁并提取质粒,最终获得构建于TRV2载体的基因敲除文库。

5.权利要求4所述构建方法得到的番茄基因敲除文库在获得突变番茄植株中的应用。

6.一种获得突变番茄植株的方法,其特征在于,包括以下步骤:利用所述番茄基因敲除文库的农杆菌侵染转基因番茄植株的幼苗。

7.根据权利要求6所述方法,其特征在于,所述转基因番茄植株的制备方法,包括以下步骤:(1)扩增番茄抗除草剂基因ALS1,利用点突变的方法将其编码蛋白的第186位氨基酸Pro的编码序列CCA突变为CT,得ALS1CCA→CT;

(2)将所述ALS1CCA→CT与Cas9基因共同构建于双元载体pCAMBIA1300;

(3)将所述双元载体pCAMBIA1300转化至番茄中,得同时过量表达Cas9和ALS1CCA→CT的转基因番茄植株。

8.根据权利要求7所述方法,其特征在于,编码所述番茄抗除草剂蛋白ALS1的核苷酸序列为Solyc03g044330。

9.根据权利要求7所述方法,其特征在于,步骤(1)所述点突变为修改1个碱基同时删除一个碱基A,被删除的碱基A位于一个PAM位点前方第四个碱基处。

10.根据权利要求7所述方法,其特征在于,步骤(2)所述双元载体pCAMBIA1300中Cas9由拟南芥pAtUBQ启动子驱动表达,ALS1CCA→CT由35S启动子驱动表达。