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专利号: 2020101719775
申请人: 湖南师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种提高淀粉酶活性的青霉菌株,其特征在于:所述青霉菌株命名为Δ13AOAmyRΔCreA菌株,该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:M 2019834,保藏日期:2019年10月17日。

2.一种如权利要求1所述提高淀粉酶活性的青霉菌株的构建方法,其特征在于:包括以下步骤:

(1)扩增获得草酸青霉CreA编码区上游约2kb 的启动子区以及约2kb终止子区作为交换同源臂;

(2)扩增两端带有six剪切位点pyrG序列;

(3)将步骤(1)(2)获得的三段序列采用Double-joint PCR方法融合得到CreA敲除盒;

~

(4)将步骤(3)制备的CreA敲除盒转入已敲除amy13A同时过表达amyR菌株含β-rec 酶的营养缺陷菌株,获得转化子OamyRΔCreA;

(5)挑选步骤(4)中获得的正确转化子OamyRΔCreA,并进行 PCR 验证;

(6)将获得的正确转化株涂布在以木聚糖为唯一碳源同时含 0.1%的5’-氟乳清酸分单孢平板上进行反向筛选,PCR 验证并筛选不含 pyrG 筛选标记的Δ13AOAmyRΔCreA菌株。

3.如权利要求2所述一种提高淀粉酶活性的青霉菌株的构建方法,其特征在于:所述构建方法还包括:在以 1%淀粉为唯一碳源的液体培养基中发酵培养步骤6)获得的不含 pyrG 筛选标记的Δ13AOAmyRΔCreA菌株,再测定不同发酵时间中发酵液的淀粉酶酶活。

4.如权利要求2或3所述一种提高淀粉酶活性的青霉菌株的构建方法,其特征在于:步骤(1)的具体操作为:

将草酸青霉菌株接种到菌丝培养基上培养,并提取基因组,设计CreA编码区上游约 2 kb 的启动子区以及约 2 kb 终止子区扩增引物,获得交换同源臂;

所述CreA上游同源臂扩增引物序列如下:上游引物CreA-F:

GGGCTCTTGAGGTTCATTGC下游引物CreA-PYRG-R:

AGTTGCTAGCGACTGTATACCTTCCTTATCGGGATCGTGACAAGG所述CreA下游游同源臂扩增引物序列如下:上游引物CreA-PYRG-F:

TGCGGCCGCTTCACGTGTGAACGCGTGGGCTCAGTGGTTCTA下游引物CreA-R:

AAAGTGTCAGCAGGTCTCGGPCR反应体系(20 μL):2 μL Ex Taq Buffer(10×),1.6 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L),上游引物0.6 μL(10 μmol/L)、下游引物 0.6 μL(10 μmol/L),模板 1 μL,0.2 μLTaKaRa Ex Taq(5 U/μL),14 μL H2O;

PCR反应程序:95 ℃预变性5 min;30个循环:95 ℃,30 sec;58 ℃,30 sec;72 ℃,2 min;72 ℃,10 min;

草酸青霉CreA上、下游同源臂PCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测并回收。

5.如权利要求2或3所述一种提高淀粉酶活性的青霉菌株的构建方法,其特征在于:步骤(2)的具体操作为:

利用细菌质粒提取试剂盒提取细菌质粒,设计pyrG 序列扩增引物扩增pyrG 序列,得到两端带有 six 剪切位点 pyrG 序列;

所述pyrG 序列扩增引物的序列如下:上游引物SIX-PYRG-F :GGAAGGATACAGTCGCTAGC下游引物SIX-PYRG-R :CGTTCACACGTGAAGC两端带有 six 剪切位点 pyrG 序列的PCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测并回收。