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专利号: 2020101223021
申请人: 安徽医科大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:rhTSG-6蛋白标准品、含有VSV N基因片段的重组质粒标准品;RT-PCR反应液;

所述VSV N基因片段的基因序列如SEQUENCE LISTING 400〈4〉所示;

所述RT-PCR反应液为:SYBR Premix Ex Taq 10MIUⅡ(2×)10μL、10μM上游引物0.8μL、

10μM下游引物0.8μL、cDNA模板2μL,补无菌水至20μL;

所述cDNA的制备方法为:以rhTSG-6蛋白标准品溶液作用MDBK细胞24h,再用VSV病毒悬液感染作用后的MDBK细胞,提取这些感染细胞的总RNA,再经逆转录后得到cDNA。

2.根据权利要求1所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒,其特征在于,所述上游引物为:5’-CGG AAT AAA CAT CGG GAA AG-3’;

所述下游引物为:5’-CCA AGT AGA TAC AAA GGC AAC C-3’。

3.根据权利要求1所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒,其特征在于,所述VSV病毒的病毒悬液的滴度为100TCID50/0.1mL;VSV病毒感染作用后的MDBK细胞的时间为24h。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒,其特征在于,所述含有VSV N基因片段的重组质粒标准品的制备方法包括以下步骤:(1)使用上游引物和下游引物,利用RT-PCR方法从VSV病毒扩增出VSV N基因片段;

(2)将VSV N基因片段连接至pMD18T载体上,构建的重组质粒pMD18T-VSV N;

(3)将重组质粒pMD18T-VSV N转化至大肠埃希菌DH5α,在含100μg/mL Amp的LB培养基中增殖,裂解法提取,经试剂盒纯化,即可得到含有VSV N基因片段的重组质粒标准品。

5.根据权利要求4所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒,其特征在于,步骤(1)中,所述RT-PCR反应体系为RT-PCR反应体系为:Premix Taq(2×)12.5μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL、cDNA模板1μL,补无菌水至25μL;

6.根据权利要求4所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒,其特征在于,步骤(2)中,连接反应体系为:pMD18-T Vector 1μL、VSV N基因片段2μL、

5μLSolutionⅠ灭菌水2μL,反应条件为16℃反应2h。

7.如权利要求1-6任意一项所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒在检测rhTSG-6抗病毒活性中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,利用重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒检测rhTSG-6抗病毒活性的方法包括以下步骤:

9 8 7

(a)将含有VSV N基因片段的重组质粒标准品稀释至2.96×10 、2.96×10 、2.96×10 、

2.96×106、2.96×105、2.96×104、2.96×103、2.96×102、2.96×101copies/μL;

(b)以稀释后的含有VSV N基因片段的重组质粒标准品作为荧光定量RT-qPCR反应的模板,设置反应程序,进行荧光定量RT-qPCR反应;荧光定量RT-qPCR反应体系为:SYBR Premix Ex Taq 10MIU Ⅱ(2×)10μL、10μM上游引物0.8μL、10μM下游引物0.8μL、cDNA模板2μL,补无菌水至20μL;

(c)根据含有VSV N基因片段的重组质粒标准品拷贝数的对数值和反应循环数的线性关系,构建标准曲线;

(d)在进行待测样品的抗病毒活性时,以待测样品作用MDBK细胞24h,用VSV感染作用后的MDBK细胞,提取总RNA,再经逆转录后得到cDNA;然后进行步骤(b)中的荧光定量RT-qPCR反应,根据得到反应循环数即可从标准曲线上得到待测样品的抗病毒活性。

9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述步骤(b)中,荧光定量RT-qPCR反应程序为:95℃ 30s,1个循环;95℃ 5s、58℃ 30s,40个循环。