1.一种腈水解酶突变体,其特征在于所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列进行下列之一突变:(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第151位苏氨酸突变为缬氨酸;(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第151位的苏氨酸突变为缬氨酸,同时将第223位半胱氨酸突变为丙氨酸和第250位半胱氨酸突变为甘氨酸。
2.一种权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因。
3.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在催化1‑氰基环己基乙腈制备1‑氰基环己基乙酸中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述的应用以含腈水解酶突变体编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞或者湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂,以1‑氰基环己基乙腈为底物,以pH=7.0、200mM磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液为反应介质构成反应体系,在25‑50℃恒温水浴中反应,反应完全后,将反应液分离纯化,获得1‑氰基环己基乙酸。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述底物终浓度以缓冲液体积计为100~
1200mM,所述催化剂用量以湿菌体重量计为10 100g/L缓冲液。
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6.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述反应温度为35℃。
7.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将含腈水解酶突变体编码基因工程菌接种到LB培养基中,37℃培养10‑12小时,按体积浓度2%的接种量接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基,37℃培养至培养液的OD600为0.6‑0.8之间,加入终浓度为0.1mM异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷,28℃诱导培养10小时,离心,收集菌体,用生理盐水清洗2次,得到湿菌体。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述纯酶按如下方法制备:(1)将湿菌体用含终浓度300 mM NaCl 的pH 8.0、50 mM NaH2PO4缓冲液重悬,超声波破碎,破碎产物12000 rpm离心10 min后,取上清液作为粗酶液;所述超声波破碎是在400 W下25 min,1s破碎1s暂停;(2)将粗酶液以1 mL/min的流速通过经平衡缓冲液冲洗的Ni‑NTA柱,用洗脱缓冲液洗脱弱吸附的杂蛋白,流速为2 mL/min;再用蛋白洗脱缓冲液洗脱并收集目的蛋白,流速为2 mL/min;最后将收集的目的蛋白以50mM磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液为透析液进行透析,取截留液即为纯酶;所述平衡缓冲液为含终浓度300 mM NaCl 的pH 8.0、50 mM NaH2PO4缓冲液;所述洗脱缓冲液为含终浓度300 mM NaCl和50 mM咪唑的 pH 8.0、50 mM NaH2PO4缓冲液;所述蛋白洗脱缓冲液为含终浓度300 mM NaCl和250 mM 咪唑的pH 8.0、50 mM NaH2PO4缓冲液。
9.如权利要求7所述的应用,其特征在于湿菌体固定化细胞按如下方法制备:将湿菌体悬浮于pH=7.0、200 mM磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液体系中,加入终浓度6mg/mL硅藻土,室温搅拌1h,随后加入质量浓度5%聚乙烯亚胺水溶液,室温搅拌1h;最后加入质量浓度25%戊二醛水溶液,搅拌0.5h,真空抽滤,获得固定化细胞;所述聚乙烯亚胺水溶液体积加入量以缓冲液体积计为3%,所述戊二醛水溶液体积加入量以缓冲液体积计为1%。