1.一种基于内标法和定量分析模型的荧光定量PCR方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)制备含有目标cDNA的标准样本,分别在标准样本和待测样本中加入内标DNA;
(2)对标准样本和待测样本进行PCR扩增,在扩增指数期内终止反应,然后测定样本扩增产物的荧光光谱;
(3)在标准样本的起始浓度与荧光光谱之间建立定量分析模型;
(4)利用定量分析模型计算待测样本中的目标cDNA含量;
步骤(3)中所述定量分析模型,建立过程如下:
(a)当第k个标准样本进行PCR扩增时,在其扩增的指数区检测到的荧光光谱用下式表达:其中,xk代表第k个标准样本在第nk个PCR循环圈数时所测得的荧光光谱数据;Na,k代表第k个样本中目标cDNA的起始浓度或目标cDNA的拷贝数;Nb,k代表第k个样本中内标DNA的起始浓度或内标DNA的拷贝数;ra和rb分别代表单位浓度的目标cDNA和内标DNA与它们各自的Taqman荧光探针结合后的荧光光谱响应;dk代表背景干扰信号;Ej,k代表第k个标准样本在其第j个PCR循环圈数时的扩增效率;定义则上述公式可以简化为:
(b)使用光程估计与矫正方法计算出乘子参数pk,然后建立以下两个校正模型:pk=α1+xk·β1和 采用多元线性校正方法计算出模型参数α1、β1、α2、和β2;
(c)将模型参数α1、β1、α2、和β2代入下列公式中,得到定量分析模型:其中Na,test为待测样本中目标cDNA的含量,Nb,test为待测样本中内标DNA的含量,xtest是指添加有Nb,test内标DNA的待测样本的荧光光谱数据;
所述步骤(1)中,内标DNA的Q‑PCR产物中的序列碱基数和GC含量与目标cDNA的Q‑PCR产物一致。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR方法,其特征在于:步骤(2)中所述的荧光定量PCR扩增,采用的方法为TaqMan探针法。
3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR方法,其特征在于:TaqMan探针法中,目标cDNA的TaqMan荧光探针标记的发光基团是HEX,内标DNA的TaqMan荧光探针标记的发光基团是FAM,两条TaqMan荧光探针标记的淬灭荧光基团均为Dabcyl。