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专利号: 2019109666754
申请人: 宁波大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种基于Zr‑MOF催化活性的蛋白激酶电化学传感器,其特征在于,按如下步骤制备获得:(1)Zr‑MOF的合成

a.将提纯后的150~250mL丙酸、0.5~2mL吡咯加入到300~700mL的三口烧瓶中,在氮气保护下,加入1~5g 4‑甲酰基苯甲酸,加热至100~180℃,回流0.5~1.5h,反应结束后降至室温,低温下重结晶2~8h,析出褐色沉淀;抽滤并用二氯甲烷多次洗涤至棕红色晶体,放置真空干燥箱过夜;

b.在室温条件下,称取0.1~2g四氯化锆、0.1~2g 2‑氨基对苯二甲酸,并将它们溶解到1~5mL乙酸、10~30mL二甲基甲酰胺以及0.1~0.5mL的去离子水的混合液中,超声1~

8min使其充分溶解;称取a步骤产物10~46mg并加入上述溶液,此时溶液由黄色变为绿色;

继续超声1~8min后,将该混合溶液转移到聚四氟乙烯材质内衬的不锈钢反应釜中,置于

100~150℃烘箱中恒温反应20~30h,冷却至室温,5000~10000rpm离心10~20min得到红褐色产物,并用DMF平行洗涤三次;再将上述产物充分分散在10~70mL的乙醇溶液中浸泡18~30h,用乙醇平行洗涤三次后,放入真空干燥箱中过夜;

(2)传感器的组装

a.Au的制备

金电极使用前分别用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末进行打磨,利用超纯水通过超声清洗3次,之后置于氮气流中干燥,再将其浸泡于0.1M H2SO4溶液中,在‑0.3V~+1.2V范围内进行循环伏安扫描5~30min,最后再经超纯水清洗后氮气吹干备用,标记为Au;

b.Pp/Au的制备

①将2~10μL底物多肽滴涂于处理好的Au表面,于4℃冰箱中静置过夜,用去离子水缓缓清洗Au表面,用N2吹干;②总体积为20μL的PKA反应液的配制:分别取PKA、ATP、PKA反应缓冲液和一定量的水;混匀后,滴至①中电极表面,在25~35℃下孵育1~2h,随后蒸馏水缓缓冲洗电极,标记为Pp/Au;其中PKA浓度0~500U/mL,用量为0.5~1.5μL;ATP浓度为0.1~

0.5mM,用量为1~2μL、PKA反应缓冲液用量为1~3μL;

c.Zr‑MOF/Pp/Au的制备

取2~10μL含有步骤(1)所合成的Zr‑MOF的溶液,滴到Pp/Au表面,室温下孵育0.5~2h,随后蒸馏水缓缓冲洗电极,保存于4℃冰箱中,备用,标记为Zr‑MOF/Pp/Au。

2.根据权利要求1所述的基于Zr‑MOF催化活性的蛋白激酶电化学传感器的应用,其特征在于:应用于不同浓度PKA检测及其小分子抑制剂筛选。

3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,应用于不同浓度PKA检测的方法如下:按照权利要求1的方法制备所述基于Zr‑MOF催化活性的蛋白激酶电化学传感器,在Pp/Au制备过程中,改变PKA浓度,制备一系列传感器,用来检测不同浓度PKA条件下,传感器在PBS缓冲液中的电化学响应,获得不同浓度PKA对应的峰电流大小,建立电流响应与PKA浓度之间的定量关系,根据两者之间的定量关系,确定待测样品中PKA含量;其中所述PBS缓冲液浓度为

0.1M,pH=7.0,含有10mM的H2O2。

4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,小分子抑制剂为H‑89。

5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,小分子抑制剂H‑89的IC50为24.9nM。